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October 08, 2021
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यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एक केंद्रीय मस्तिष्क की चोट विधि को प्रदर्शित करता है जो ड्रोसोफिला में वयस्क न्यूरोजेनेसिस को ट्रिगर करता है, जहां आमतौर पर कोई नहीं होता है। हम उम्मीद करते हैं कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए इस तकनीक का उपयोग करना मानव तंत्रिका उत्थान के लिए प्रासंगिक होगा। इस तकनीक को सीखने के लिए धैर्य और दृढ़ता की आवश्यकता होती है।
हम विश्लेषण के लिए दिमाग इकट्ठा करने से पहले कई हफ्तों तक दैनिक पांच से 10 दिमागों पर अभ्यास करने की सलाह देते हैं। एक कार्बन डाइऑक्साइड पैड पर मक्खियों anesthetizing के बाद. एक्लोज़न के छह घंटे के भीतर नए eclosed F1 युवा पुरुष मक्खियों को सॉर्ट करें और उन्हें प्रति शीशी 40 या उससे कम मक्खियों के साथ भोजन युक्त साफ शीशियों में रखें।
यदि ईडीयू के साथ विभाजित कोशिकाओं को लेबल करने की योजना बना रहे हैं, तो 10% सुक्रोज में 50 मिल या अधिक ईडीयू के 200 माइक्रोलीटर तैयार करें और तैयार समाधान को एक खाली शीशी में 23 मिलीमीटर गोल ग्रेड तीन फिल्टर पेपर पर रखें, फिर चोट से छह घंटे पहले पूर्व-खिलाने के लिए पुरुष मक्खियों को शीशी में रखें। इसके बाद, पांच मिनट के लिए 70% इथेनॉल से भरे 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लगभग 100 पिन रखकर मिनुटिन पिन को सैनिटाइज करें। फिर 70% इथेनॉल छिड़काव करके और एक साफ लिंट-मुक्त ऊतक के साथ सूखी पोंछकर कार्बन डाइऑक्साइड पैड और पेंटब्रश को सैनिटाइज करें।
एक बार जब उपकरण साफ और सूखे हो जाते हैं, तो 40 या उससे कम सॉर्ट किए गए एफ 1 पुरुषों को साफ पैड पर स्थानांतरित करें और उन्हें दो समूहों में अलग करें। एक समूह नियंत्रण uninjured मक्खियों के रूप में काम करेगा। और दूसरे प्रयोगात्मक समूह को मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के अधीन किया जाएगा।
अगला, संदंश का उपयोग करके माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से चार से पांच नए मिनुटिन पिन खींचें और उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड पैड के किनारे के पास रखें। फिर विच्छेदन क्षेत्र के तहत एक तेज बिंदु के साथ एक सीधा मिनुटिन पिन चुनें। तेज पिन का पुन: उपयोग करें और सुरक्षित निपटान के लिए 70% इथेनॉल युक्त एक अलग ट्यूब में क्षतिग्रस्त या कुंद पिन रखें।
इसके बाद, स्टीरियो माइक्रोस्कोप एलईडी लैंप पर मानक क्रॉस जीनोटाइप स्विच के साथ मक्खियों के लिए हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर से सुसज्जित है जो 440 से 460 नैनोमीटर पर उत्तेजना की अनुमति देता है और 500 से 560 नैनोमीटर पर विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। फिर प्रयोगात्मक समूह को एक मक्खी चुनें और मक्खी को इस तरह से स्थिति दें कि प्रयोगकर्ता के पास दाईं ओर मक्खियों के सिर के साथ सिर कैप्सूल का पृष्ठीय दृश्य हो। संदंश का उपयोग करके एक हाथ में चयनित मिनुटिन पिन को उठाएं और पकड़ें, और दूसरे हाथ में पेंटब्रश।
फिर ब्रश को पृष्ठीय वक्ष के पूर्वकाल पर रखें और मक्खी को स्थिर करने के लिए धीरे से नीचे धकेलें। सिर के दाईं ओर मशरूम निकायों सेल निकायों पर Minutien पिन की नोक का लक्ष्य और सिर कैप्सूल में प्रवेश. यदि स्थलों का उपयोग करके ओसेली और आंख के पृष्ठीय रिम के बीच पृष्ठीय सिर छल्ली को लक्षित करते हैं।
चोट को पूरा करने के बाद, पेंटब्रश का उपयोग करें ताकि सिर को धीरे से मिनुटियन पिन से धक्का दिया जा सके। यदि आरएनए अनुक्रमण या क्यूआरटी पीसीआर के लिए मस्तिष्क का उपयोग करना हमें सिर के बाईं ओर दूसरी चोट पहुंचाता है। एक बार जब सभी प्रयोगात्मक मक्खियों को घायल कर दिया जाता है, तो नियंत्रण और घायल मक्खियों को भोजन युक्त अलग-अलग लेबल वाली शीशियों में रखा जाता है।
मक्खियों को भोजन में पकड़े जाने से रोकने के लिए शीशियों को क्षैतिज रूप से रखें। मानक क्रॉस मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें और पर्माटविन मक्खियों को उम्र के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यदि उम्र बढ़ने की उम्र 24 घंटे से अधिक है, तो हर एक से दो दिनों में साफ भोजन पर मक्खियों को स्थानांतरित करें।
प्रसार में एक महत्वपूर्ण वृद्धि 24 घंटे के बाद चोट के बाद एंटी पीएच 3 का उपयोग करके सक्रिय रूप से माइटोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं के लिए एक मार्कर का उपयोग करके देखी गई थी। नियंत्रण केंद्रीय दिमाग में से प्रत्येक में लगभग तीन पीएच 3 सकारात्मक कोशिकाएं देखी जाती हैं। और घायल केंद्रीय दिमाग में से प्रत्येक में 11 पीएच 3 सकारात्मक कोशिकाएं।
सात दिनों तक, नियंत्रण सेल दिमाग में से प्रत्येक में दो ईडीयू सकारात्मक कोशिकाओं का औसत मौजूद होता है। और घायल केंद्रीय दिमागों में से प्रत्येक में 11 ईडीयू सकारात्मक कोशिकाएं, जो पीएच 3 एंटीबॉडी के साथ 24 घंटे बाद की चोट के बाद प्राप्त परिणामों के समान हैं। 14 दिनों में नियंत्रण ने प्रति केंद्रीय मस्तिष्क एक ईडीयू सकारात्मक कोशिका का औसत निकाला, और घायल दिमाग ने प्रति केंद्रीय मस्तिष्क में 29 ईडीयू सकारात्मक कोशिकाओं का औसत निकाला।
यह प्रदर्शित करते हुए कि कोशिका प्रसार कम से कम दूसरे सप्ताह में एक मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बाद जारी रहता है। केंद्रीय मस्तिष्क में सबसे मजबूत प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया तब देखी जाती है जब मस्तिष्क एक्लोशन के बाद पहले 24 घंटों के भीतर घायल हो जाते हैं। सात दिनों तक एक्क्लोज़न के बाद एक मर्मज्ञ चोट अभी भी प्रसार में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनती है।
हालांकि, 14 दिनों तक, विभाजित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता प्रति मस्तिष्क एक विभाजित कोशिका तक काफी कम हो जाती है। जो नियंत्रण मस्तिष्क के समान है। Permatwin लेबलिंग प्रणाली का उपयोग कर अधिक permatwin क्लोन दो दिनों में घायल नमूनों में पाया गया था, दो सप्ताह में, नियंत्रण की तुलना में.
चोट के बाद समय के साथ क्लोन की संख्या में वृद्धि के साथ। चोट के दो सप्ताह बाद घायल दिमाग के 50% में नए मशरूम बॉडी न्यूरॉन्स थे। इन नए न्यूरॉन्स ने मशरूम बॉडी कैलिक्स के लिए लगभग अपने डेंड्राइट्स का अनुमान लगाया, और मशरूम बॉडी लोब के लिए अक्षतंतु।
मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों जो पुनर्जीवित करने के लिए दिखाई दिए, उनमें अंडाकार शरीर एंटीनेल लोब और पार्श्व सींग शामिल हैं। मस्तिष्क की चोटों को करते समय एक तेज मिनुटिन पिन का उपयोग करना सुनिश्चित करें क्योंकि एक सुस्त या मुड़े हुए पिन का उपयोग मृत्यु दर में वृद्धि करेगा। यह भी सुनिश्चित करें कि पेंट ब्रश के साथ मक्खियों पर बहुत कठिन धक्का न दें क्योंकि इससे मृत्यु दर में भी वृद्धि होगी।
इस प्रक्रिया के बाद, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग आत्म प्रसार को मापने और नए न्यूरॉन्स और ग्लिया की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
यह लेख वयस्क ड्रोसोफिला को मर्मज्ञ दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (पीटीबीआई) देने और परिणामी न्यूरोजेनेसिस की जांच करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
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Crocker, K. L., Ahern-Djamali, S., Boekhoff-Falk, G. Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain. J. Vis. Exp. (176), e63182, doi:10.3791/63182 (2021).
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