Stimulera och analysera vuxen neurogenes i Drosophila Central Brain

Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det visar en central hjärnskada metod som utlöser vuxna neurogenes i Drosophila, där det normalt inte finns någon. Vi förväntar oss att använda denna teknik för att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för vuxna neurogenes kommer att vara relevanta för mänskliga neurala regenerering. Att lära sig denna teknik kräver tålamod och uthållighet.

Vi rekommenderar att du övar på fem till tio hjärnor dagligen i flera veckor innan du samlar hjärnor för analys. Efter bedövning av flugorna på en koldioxidplatta. Sortera nyemitterade F1 unga hanflugor inom sex timmar efter eklosion och placera dem i rena flaskor som innehåller mat med 40 eller färre flugor per flaska.

Om du planerar att märka delningsceller med EdU förbereder 200 mikroliter av 50 kvarn eller mer EdU i 10% sackaros och placera den beredda lösningen på ett 23 millimeter runt klass tre filterpapper i en tom flaska, placera sedan hanflugorna i injektionsflaskan för förmatning sex timmar före skadan. Sanera sedan Minutien Pins genom att placera cirka 100 stift i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugerrör fyllt med 70% etanol i fem minuter. Sanera sedan koldioxidkudden och penseln genom att spruta 70% etanol och torka torr med en ren luddfri vävnad.

När verktygen är rena och torra, överför 40 eller färre sorterade F1-hanar till den rena dynan och dela upp dem i två grupper. En grupp kommer att fungera som kontrollen oskadda flugor. Och den andra experimentella gruppen kommer att utsättas för genomträngande traumatisk hjärnskada.

Därefter drar tångar fyra till fem nya Minutien-stift ut ur mikrocentrifugerröret och placerar dem nära kanten av koldioxidplattan. Välj sedan under dissekeringsomfånget en rak Minutien-stift med en skarp punkt. Återanvänd vassa stift och placera skadade eller trubbiga stift i ett separat rör som innehåller 70% etanol för säkert bortskaffande.

Därefter för flugor med standardkorsgenotypbrytaren på stereomikroskopETS LED-lampa utrustad med lämpliga excitations- och emissionsfilter för det gröna fluorescensproteinet som tillåter excitation vid 440 till 460 nanometer och möjliggör visualisering vid 500 till 560 nanometer. Välj sedan en fluga den experimentella gruppen och placera flugan så att experimenteraren har en dorsal utsikt över huvudkapseln med flugorna huvudet till höger. Använd tång plocka upp och hålla den valda Minutien stiftet i ena handen, och penseln i den andra handen.

Placera sedan borsten på den främre delen av dorsala bröstkorgen och tryck ner försiktigt för att stabilisera flugan. Sikta Minutien-stiftets spets mot svampkropparnas cellkroppar på höger sida av huvudet och penetrera huvudkapseln. Om du använder landmärken rikta in sig på dorsala huvud nagelband mellan ocelli och dorsala kanten av ögat.

När du har slutfört skadan, använd penseln för att trycka huvudet försiktigt från Minutien-stiftet. Om du använder hjärnan för RNA-sekvensering eller QRT PCR gör oss andra skada på vänster sida av huvudet. När alla experimentella flugor har skadats placerar kontrollen och skadade flugor i separata märkta flaskor som innehåller mat.

Lägg injektionsflaskan horisontellt för att förhindra att flugor fastnar i maten. Placera standardkorsflugorna vid 25 grader Celsius och permatwinflugor vid 30 grader Celsius för att åldras. Om åldrandet är längre än 24 timmar överför flugorna på ren mat varannan till två dagar.

En betydande ökning av spridningen observerades 24 timmar efter skada med hjälp av anti pH3 en markör för celler som aktivt genomgår mitos. Ungefär tre pH3-positiva celler observeras i var och en av kontrollcentralhjärnorna. Och 11 pH3 positiva celler i var och en av de skadade centrala hjärnorna.

Vid sju dagar finns i genomsnitt två EdU-positiva celler i var och en av kontrollcellens hjärnor. Och 11 EdU-positiva celler i var och en av de skadade centrala hjärnorna, vilket liknar resultaten som erhållits 24 timmar efter skada med pH3-antikroppar. Vid 14 dagars kontroller i genomsnitt en EdU positiv cell per central hjärna, och skadade hjärnor i genomsnitt 29 EdU positiva celler per central hjärna.

Visar att cellproliferation fortsätter åtminstone in i den andra veckan efter en genomträngande traumatisk hjärnskada. Det starkaste proliferativa svaret i den centrala hjärnan observeras när hjärnor skadas inom de första 24 timmarna efter eklosion. Efter sju dagar efter utgåendet orsakar en genomträngande skada fortfarande en betydande ökning av spridningen.

Men med 14 dagar minskar cellernas förmåga att dela sig avsevärt till en delningscell per hjärna. Vilket liknar kontrollhjärnornas. Med hjälp av permatwin märkning systemet mer permatwin kloner upptäcktes i skadade prover på två dagar, i två veckor, jämfört med kontroller.

Med antalet kloner ökar med tiden efter skada. Två veckor efter skadan fanns det nya svampkropp nervceller i 50% av de skadade hjärnorna. Dessa nya nervceller projicerade sina dendriter ungefär till svampkroppen calyx och axoner till svampkroppsloberna.

Andra områden i hjärnan som tycktes regenerera inkluderar ellipsoid kroppen Antennal lober och laterala horn. Var noga med att använda en skarp Minutien stift när du gör hjärnskador som användning av en tråkig eller böjd stift kommer att öka dödligheten. Se också till att inte trycka för hårt på flugorna med penseln eftersom detta också kommer att öka dödligheten.

Efter denna procedur kan immunohistokemi användas för att kvantifiera självproliferation och även för att identifiera nya nervceller och glia.