Biology
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電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)
Chapters
Summary February 9th, 2022
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本プロトコルは、電気生理学的研究に適した、成体、幼若、幼虫、および胚性ゼブラフィッシュ(Danio rerio)からの生存可能な心臓および血管平滑筋細胞の急性単離を記載している。
Transcript
パッチクランプ電気生理学を用いて天然のイオンチャネル特性を研究するには、急性に単離された細胞へのアクセスが必要です。このプロトコルは、異なる年齢のゼブラフィッシュから個々の心血管筋細胞にアクセスする方法を説明しています。このプロトコルは堅牢で、シンプルで、再現性が容易で、比較的高い収量と生存率で天然状態のゼブラフィッシュから心血管筋細胞を分離します。
はじめに、魚を灌流緩衝液で部分的に満たした大きなペトリ皿に移し、それを解剖顕微鏡の下に置きます。腹側を解剖スコープに向けて、利き手ではない手で魚を持ちます。利き手の細い鉗子で、魚の胸筋とひれをそっと引き裂いて、心房、心室、球動脈などの心臓血管組織を明らかにします。
球根動脈と腹側大動脈の交差する先端で球根動脈をそっと引っ張ります。鉗子をつまんで大動脈から球根動脈を慎重に分離し、心房の先端を収束する複数の静脈枝に配置します。次に、心房の先端を副鼻腔静脈から引き抜き、心臓血管組織を体の他の部分から隔離します。
心筋細胞を解剖するには、心房と心室を心血管組織から引き抜きます。細かい鉗子を使用して心室に穏やかな裂け目を作り、心臓組織が明るい赤から淡いサーモン色に変わったときに確実にできる余分な血液を排出します。単離された心房と心室を灌流バッファーを含む別の1.5ミリリットルの遠沈管にプールします。
チューブ内の灌流バッファーを750マイクロリットルの消化バッファーと交換します。チューブを摂氏37度、毎分800回転のサーモシェーカーに置きます。組織が半透明になるまで消化できるようにします。
ベンチトップミニ遠心分離機で組織を2, 000倍Gで3〜5秒間静かに回転させて消化を終了し、上清消化バッファーを750マイクロリットルの停止バッファーと交換します。停止バッファーを500〜750マイクロリットルの灌流バッファーに静かに交換し、火炎研磨されたパスツールピペットを使用して組織を30回粉砕して細胞を分散させます。次に、心室を静かに粉砕します。
均一なサンプリングを行うには、細胞を数回ゆっくりと上下にピペットで動かして再懸濁してから、対応する研究のために細胞を一滴加えます。心臓血管組織から成体の球動脈を摘み取り、5つの球根動脈をS1バッファーを含む1.5ミリリットルの遠沈管にプールします。S1を400マイクロリットルのS2バッファーに置き換え、サーモシェーカーで摂氏37度、毎分800回転で20分間、球根動脈のパパイン消化を可能にします。
部分的に消化された球根動脈を1分間落ち着かせ、S2上清をコラゲナーゼを含む500マイクロリットルのS3バッファーと交換します。サーモシェーカーで37°C、毎分800回転で3〜5分間組織を消化します。ベンチトップミニ遠心分離機で2, 000倍Gで3〜5秒間組織を静かに回転させて消化を終了し、S3上清を500マイクロリットルのS1と交換します。ペレット化された組織を穏やかに粉砕して、血管平滑筋細胞を分散させます。
適切なサイズのガラスカバースリップ上に分散した血管平滑筋細胞をプレート化します。カバースリップを室温で30分間保持してセルを付着させ、次の6時間以内に使用してください。胚を麻酔します。
次に、胚を5ミリリットルの遠沈管に移して濃縮し、余分な培地を取り除きます。胚を3ミリリットルの冷灌流バッファーで2回洗浄した後、2ミリリットルの灌流バッファーに再懸濁します。胚性心臓隔離装置を使用して、1ミリリットルの胚を針に引き込み、直ちにチューブに戻します。
断片化した胚を漏斗に入れた100マイクロメートルの細胞ストレーナーふるいに通します。ろ過した心臓を別の5ミリリットルの遠心チューブに集めます。ろ液をよく混合し、1ミリリットルのアリコートを1.5ミリリットルの遠沈管に分離します。
ベンチトップミニ遠心分離機ですべてのチューブを5秒間遠心分離し、上清を廃棄します。1ミリリットルの灌流バッファーを使用して、チューブ内のペレットの連続再懸濁を実行します。心臓を2回軽くピペットで動かしてから、対応する研究のために滴を加えます 球根動脈から単離された細胞について、血管平滑筋細胞をtagln:EGFP発現によって確認した。
単離された心筋細胞からのATP感受性カリウムチャネル活性の記録の代表的な痕跡がここに示されています。成功したシングルチャンネル録音は、胚の心臓から摘出されたパッチで得られました。心室筋細胞は安定した過分極膜電位を示し,パッチピペットによる電流注入により活動電位を刺激した。
心房筋細胞は自発的な活動電位発火を示した。活動電位特性はここに要約されています。心筋細胞解離中に緩衝液を交換する際には、消化組織が乱されないように注意する必要があります。
組織の断片化は、ピペット粉砕によってのみ達成されるべきです。球根組織のコラーゲン消化中に、毎分浮遊、拡張、および半透明の組織を調べます。組織の断片化が明らかになったら、消化を中止します。
細胞が単離されると、それらは何時間も生き続け、パッチクランプ技術を使用した電気生理学的分析に使用できます。これにより、例えば、これらのゼブラフィッシュ組織におけるATP感受性カリウムチャネルが哺乳類のものと本質的に同一であることを示すことができました。
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