Neuroscience
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyser av Actin Dynamics, ClutchKobling og Trekkraft Force for Growth Cone Advance
Chapters
Summary October 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
For å fremme må vekstkjegler utøve trekkraftkrefter mot det ytre miljø. Genereringen av trekkraftkrefter er avhengig av aktindynamikk og clutchkobling. Den nåværende studien beskriver metoder for å analysere aktindynamikk, clutchkobling og trekkraft krefter for vekst kjegle fremskritt.
Transcript
Koblingsanalyse av enkeltflekkavbildning og trekkraft kraftmikroskopisk kan analysere molekylære maskinerier for vekstkjeglefremgang og navigasjon. Som teknikkene bruker kommersielt tilgjengelige materialer og standard mikroskoper. Forskere kan bokstavelig talt tilpasse seg teknikkene i studiene sine.
Begynn med å behandle nevronene med tetrametyl-rhodamin eller TMR ligand ved en fortynning av en til 2000 i kulturmedium på dagen in vitro 3. Oppretthold deretter nevronene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time. Etter inkubasjon, vask TMR-ligand tre ganger med forvarmet PBS.
Fjern PBS før du tilsetter 0,5 milliliter varmet Leibovitz L-15 medium inn i nevronene. Oppretthold nevronene ved 37 grader Celsius i en time. Deretter slår du på et epifluorescence mikroskop og setter tilstandstoppinkubatoren til 37 grader Celsius.
Plasser deretter TMR ligandbehandlede nevroner i glassbunnsfatet på den oppvarmede scenen topp inkubator. Angi bildeanskaffelsesparameterne, for eksempel eksponeringstid, til 500 millisekunder for en Lifeact- og HaloTag-aktinfluorescenskanaler og binning som 0,065 mikron med 0,065 mikron per piksel med et tidsintervall på tre sekunder for 50 bilder. Etter å ha valgt en vekstkegle som sterkt uttrykker Lifeact og ukentlig uttrykker HaloTag-actin.
Lukk feltet på membranen for å belyse et minimumsområde som inkluderer vekstkjeglen og skaffe tidsforløpbilder. På dagen in vitro 3, erstatt kulturmediet med 0,5 milliliter varmet Leibovitz L-15 medium og vedlikehold nevronene i en time ved 37 grader Celsius. For trekkraftmikroskopi, slå på et laserskanningskonfokalt mikroskop og sett trinntoppen inkubator til 37 grader Celsius.
Plasser nevronene på glassbunnsfatet på den forhåndsvarslete trinnstoppinkubatoren. Angi bildeanskaffelsesparametrene som beskrevet i menyskriptet, og velg en vekstkegle som sterkt uttrykker forbedret grønt fluorescensprotein eller EGFP. Fokuser på geloverflaten og få tidsforløpbilder.
Når du er ferdig, bruker du en bildebehandlingsprogramvare til å produsere RGB-bildestakker med én kanal. Deretter lagrer du bildene som TIFF-filer. Deretter bruker du 100 mikroliter med 10% vekt ved volum natrium dodecylsulfat eller SDS oppløst i destillert vann til glassbunnsfatet for å slappe av gelsubstratet ved å frigjøre nevroner fra substratet.
Inkuber deretter parabolen i scenen topp inkubator i fem minutter ved 37 grader Celsius for å stabilisere temperaturen. I laserskanning konfikale mikroskop, fokuser på geloverflaten for å få et bilde av perlene i det ubegrensede substratet. Lag et RGB-bilde med én kanal av perlene i det ubegrensede underlaget, og lagre dette bildet som en TIFF-fil.
Last ned trekkraft analysekode TFM2021 og åpne TFM2021 i MATLAB. Åpne hoveddelen. m i TFM2021 og kjør den.
Når et grafisk brukergrensesnitt vises på skjermen. Klikk på last utrent, substratbilde og velg X-Y posisjon korrigert perle bilde i det ubegrensede substratet. Gå for å laste fluorescerende perlebilder og velg tidsforløpstakken av bildeperler.
Klikk deretter på last inn lysfeltbilder for å velge tidsforløpstakkbildet av lysfelt og bruk last inn GFP-bilder for å velge tidsforløpstakkbildet til EGFP. Fra rullegardinlisten på det grafiske brukergrensesnittet velger du GFP før du klikker på AVKASTNING for å angi rektangelområdet av interesse, inkludert vekstkjeglen, ved å klikke to punkter på det viste cellebildet. Når du er ferdig, klikker du på lagre-knappen på det grafiske brukergrensesnittet for å lagre de valgte stakkbildene sammen med avkastningen i en mattefil.
Deretter klikker du på spotgjenkjenning og legger inn ønsket verdi i dialogboksen for å bestemme en terskel for perledeteksjon. Trykk ok for å starte beregningen. Etter å ha fullført beregningen, klikk på plottsporet for å forstørre regionen som er valgt tidligere og vise de oppdagede perlene som hvite prikker.
Bruk utvalgte perler til å avgrense et polygonalt område som inneholder de riktige prikkene under vekstkjeglen. Deretter endres de hvite prikkene i det polygonale området til rødt ved å trykke enter på tastaturet. Klikk på estimatkraft i det grafiske brukergrensesnittet.
Skriv deretter inn verdier for pikselstørrelsen og Youngs modulus som forklart i manuskriptet. Sett verdien for Poissons forhold som 0,3 og utfør estimatkraft for å starte beregningen. Programvaren vil lagre beregningsresultatene i et regneark format fil.
Fluorescensbildene av en nevronal vekstkegle viste et høyt Lifeact-uttrykk som tillot visualisering av vekstkjeglemorfologi under en helt åpen og smal membran. HaloTag-actin-uttrykksnivåene var svært lave med svake signaler. Når membranen er en riktig innsnevret, reduseres bakgrunnssignalene og enkelt handling i flekker vises i vekstkjeglen.
Forskere som på en hensiktsmessig måte oppnår alle trinnene, vil observere F-aktin retrograd strømning i vekstkjeglen. Stivheten til polyakrylamidgelen ble bestemt ved å beregne dybden av innrykk forårsaket på grunn av mikrosfærens vekt. Et laserskanningskonfokalt mikroskop ble brukt til å ta bilder av geloverflaten og bunnen av mikrosfæren.
Signalene fra fluorescerende perler var ikke synlige på geloverflaten i det innrykkede området. Fluorescensbilder av perlene innebygd i polyakrylamidgelen og nevral vekstkjegle, viste perlene i deres opprinnelse og fordrevne posisjoner. EGFP-signalet om vekstkjeglen ble også observert.
Kymografiene viste perlens bevegelser sammenlignet med en referanseperle. Når du utfører en enkelt flekkete avbildning, uttrykker viktige ting å velge en nevron som ukentlig uttrykker hvordan man skal handle under to et minimumsområde. Når du utfører en trekkraftmikroskopi, er høy forstørrelsesavbildning viktig for nøyaktig konsentrasjon av trekkraft.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
