Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optisk rydning af plantevæv til fluorescensbilleddannelse
Chapters
Summary January 5th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskrives en metode til at gøre plantevæv gennemsigtigt og samtidig opretholde stabiliteten af fluorescerende proteiner. Denne teknik letter dyb billeddannelse af ryddet plantevæv uden fysisk sektionering.
Transcript
Denne metode kan være nyttig i hel-plante billeddannelse for at afsløre intakt morfologi, udviklingsprocesser og plante-mikrobe interaktioner. Den største fordel ved denne teknik er, at vi direkte kan observere indersiden af en plantekrop uden at påføre den skade. Da denne metode gælder for en lang række plantearter og væv, kan den være med til at fremskynde opdagelsen af nye fænomener inden for plantebiologisk forskning.
Fiksering er et kritisk trin i denne procedure. Før clearingtrinnet skal man kontrollere intensiteten af fluorescerende protein efter fiksering. For at begynde at nedsænke planteprøver i den fikserende opløsning i et mikrorør og sikre, at volumenet af den fikserende opløsning er mere end fem gange prøvevolumenet.
Forsegl mikrorøret med en parafilm og lav huller ved hjælp af en nål. Anbring mikrorøret i en ekssikkator og juster langsomt vakuumgraden til omkring 690 millimeter kviksølv, så der gradvist kommer bobler ud af prøverne. Sluk for vakuumpumpen efter evakuering af tørremaskinen.
Udluftning af udsnittet forsigtigt uden at forstyrre prøverne. Tænd vakuumpumpen igen, og sluk den efter evakuering af tørremaskinen. Åbn tørressikkatoren forsigtigt uden at støde den fikserende opløsning i mikrorøret.
Fjern den fikserende opløsning, og tilsæt 1x PBS med en mikropipette. Efter opbevaring i et minut skal du udskifte den gamle PBS med ny 1x PBS. Efter fjernelse af PBS ved fem gange prøvevolumenet af clearingopløsningen forsegles mikrorøret med parafilm og laves huller med en nål.
Anbring prøverne i ekssikkatoren. Evakuer og sluk for vakuumpumpen. Åbn forsigtigt tørremaskinen, og luk derefter mikrorøret.
Omvendt mikrorøret hver anden til anden dag for at fremskynde clearingprocessen. Til afstandsrammen skal du skære et silikonegummiark med et barberblad, der justerer silikonegummipladens tykkelse i henhold til prøvetykkelsen. Placer silikonerammen på et dækglas, læg derefter de behandlede prøver inden for rammen og tilsæt ca. 100 mikroliter clearingopløsning for at fjerne eventuelle bobler.
Dæk med et andet dækglas for at forhindre fordampning af rydningsopløsningen. Overhold prøverne under et fluorescerende mikroskop. Efter observation returneres prøverne til clearingopløsning i et mikrorør.
Faste blade af forskellige arter blev inkuberet i PBS eller ClearSee i otte dage, i ClearSee eller ClearSeeAlpha i to dage. ClearSee kan rydde blade af forskellige arter. Efter ekstraktion af kutikulær kunne ClearSee rydde risblade.
Da natriumsulfitkomponenten i ClearSeeAlpha forhindrer polyphenoloxidation på grund af den reducerende virkning, kan ClearSeeAlpha rydde tobaks- og tiraniapistiller uden brun pigmentering. Ubiquitin-10 promotor H2B-mClover blade af arabidopsis thaliana blev behandlet med PBS eller ClearSee i tre dage. ClearSee-behandlingen reducerede den lysegrønne farve på arabidopsis H2B-mClover-bladet og forbedrede fluorescensintensiteten af H2B-mClover sammenlignet med PBS-inkubation.
ClearSee-behandlede blade blev observeret ved to-foton-excitationsmikroskopi med 950 nanometer excitation. Cellevæggen er farvet med calcaflour-hvid. Kerner er mærket med ubiquitin-10 promotor, H2B-mClover.
Y Z- og X Z-billederne er tværsnit i den position, der er angivet med de hvide stiplede linjer. Fremstilling af den fikserende opløsning er vigtig for at fastgøre prøverne. Der skal dog sørges for at forhindre beskadigelse af prøverne under vakuum.
Mikroskopisk billeddannelse kan udføres for at studere flere genekspressionsmønstre og intracellulær kommunikation under planteudvikling og infektion efter denne procedure.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
