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January 05, 2022
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यह विधि बरकरार आकृति विज्ञान, विकास प्रक्रियाओं और पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को प्रकट करने के लिए पूरे पौधे की इमेजिंग में सहायक हो सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि हम सीधे पौधे के शरीर के अंदर का निरीक्षण कर सकते हैं, उस पर नुकसान पहुंचाए बिना। चूंकि यह विधि पौधों की प्रजातियों और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है, इसलिए यह पौधे जैविक अनुसंधान में नई घटनाओं की खोज में तेजी लाने में मदद कर सकती है।
निर्धारण इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। समाशोधन चरण से पहले, किसी को निर्धारण के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तीव्रता की जांच करने की आवश्यकता होती है। एक माइक्रो ट्यूब में fixative समाधान में संयंत्र के नमूनों को विसर्जित शुरू करने के लिए, और सुनिश्चित करें कि fixative समाधान की मात्रा नमूना मात्रा से पांच गुना से अधिक है।
एक पैराफिल्म के साथ माइक्रो ट्यूब को सील करें और एक सुई का उपयोग करके छेद करें। माइक्रो ट्यूब को एक desiccator में रखें और धीरे-धीरे वैक्यूम की डिग्री को लगभग 690 मिलीमीटर पारा में समायोजित करें ताकि बुलबुले नमूनों से धीरे-धीरे दिखाई दें। desiccator खाली करने के बाद वैक्यूम पंप बंद कर दें।
नमूनों को परेशान किए बिना desiccate ध्यान से वेंट. वैक्यूम पंप को फिर से चालू करें और डेसिकेटर को खाली करने के बाद इसे बंद कर दें। माइक्रोट्यूब में फिक्सेटिव समाधान को टक्कर दिए बिना desiccator को ध्यान से खोलें।
फिक्सेटिव समाधान निकालें और एक माइक्रो पिपेट के साथ 1x PBS जोड़ें। एक मिनट के लिए भंडारण के बाद, पुराने पीबीएस को नए 1x पीबीएस के साथ बदलें। समाशोधन समाधान के नमूना मात्रा के पांच गुना पर पीबीएस को हटाने के बाद, पैराफिल्म के साथ माइक्रो ट्यूब को सील करें और सुई के साथ छेद करें।
नमूनों को desiccator में रखें। खाली करें और वैक्यूम पंप को बंद कर दें। desiccator धीरे से खोलें, फिर माइक्रोट्यूब बंद करें।
समाशोधन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए माइक्रो ट्यूब को उलटें, हर एक से दो दिन। स्पेसर फ्रेम के लिए, नमूना मोटाई के अनुसार सिलिकॉन रबर शीट की मोटाई को समायोजित करने वाले रेजर ब्लेड के साथ एक सिलिकॉन रबर शीट काटें। एक कवर ग्लास पर सिलिकॉन फ्रेम रखें, फिर फ्रेम के भीतर इलाज किए गए नमूनों को रखें और किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए समाशोधन समाधान के लगभग 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
समाशोधन समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक और कवर ग्लास के साथ कवर करें। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का निरीक्षण करें। अवलोकन के बाद एक microtube में समाधान समाशोधन करने के लिए नमूनों को वापस.
विभिन्न प्रजातियों की निश्चित पत्तियों को आठ दिनों के लिए पीबीएस या क्लियरसी में इनक्यूबेट किया गया था, दो दिनों के लिए ClearSee या ClearSeeAlpha में। ClearSee विभिन्न प्रजातियों की पत्तियों को साफ कर सकता है। Cuticular निकालने के बाद, ClearSee चावल के पत्तों को साफ कर सकता है।
ClearSeeAlpha में सोडियम सल्फाइट घटक के रूप में कम करने के प्रभाव के कारण polyphenol ऑक्सीकरण को रोकता है, ClearSeeAlpha किसी भी भूरे रंग के रंजकता के बिना तम्बाकू और tirania pistils को साफ कर सकता है। Ubiquitin-10 प्रमोटर H2B-m Arabidopsis thaliana केclover पत्तियों को तीन दिनों के लिए PBS या ClearSee के साथ इलाज किया गया था। ClearSee उपचार arabidopsis H2B-mClover पत्ती के पीले हरे रंग को कम कर दिया और PBS इनक्यूबेशन की तुलना में H2B-mClover की प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाने.
ClearSee उपचारित पत्तियों को 950 नैनोमीटर उत्तेजना के साथ दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था। सेल की दीवार calcaflour-सफेद के साथ दाग है। नाभिक को यूबिकिटिन -10 प्रमोटर, एच 2 बी-एमक्लोवर के साथ लेबल किया जाता है।
Y Z और X Z छवियाँ सफेद धराशायी रेखाओं द्वारा इंगित स्थिति पर क्रॉस सेक्शन हैं। नमूनों को ठीक करने के लिए फिक्सेटिव समाधान की तैयारी महत्वपूर्ण है। हालांकि, वैक्यूम के तहत नमूनों को नुकसान को रोकने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए।
माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग को इस प्रक्रिया के बाद पौधे के विकास और संक्रमण के दौरान कई जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और इंट्रासेल्युलर संचार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
यहां, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखते हुए पौधे के ऊतकों को पारदर्शी बनाने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। यह तकनीक भौतिक विभाजन के बिना साफ किए गए पौधे के ऊतकों की गहरी इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है।
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Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Sato, Y., Higashiyama, T. Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (179), e63428, doi:10.3791/63428 (2022).
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