Inokulationsstrategier til at inficere planterødder med jordbårne mikroorganismer

Selvom utallige mikrober koloniserer planterødder, er disse interaktioner vanskelige at analysere, da de sker under jorden. For at lette dette giver denne protokolsamling et overblik over strategier til at inokulere planterødder med jordbårne mikrober. Rodpodning er grundlaget for at studere rodmikrobeinteraktioner, og ved hjælp af følgende teknikker kan interaktioner studeres på molekylært, cytologisk eller histologisk niveau.

Vi forklarer tre podningssystemer, der bruger verticillium som rodinvaderende mikrobe, og modelplanten, arabidopsis. Det er dog muligt at overføre metoderne til andre planter som tomat- eller raps og til andre rodmikrober, for eksempel gavnlig serendipita. Forbered verticillium inokulum på forhånd ved at dyrke myceli i PDB og inducere sporulation og Czapek dextrose bouillon.

Begynd derefter med at hælde det autoklavede medium i petriskåle. Efter hærdning af mediet pakkes petriskålene om i en steril plastikpose og opbevares på hovedet natten over i køleskabet ved fire til 10 grader Celsius. Skær og fjern en infektionskanal i den øverste tredjedel af det størknede medium med en skalpel.

Undgå at få væske eller luft under agarmediet, mens du skærer. Brug derefter en steril pipettespids til at fordele 50 til 100 overfladesteriliserede arabidopsisfrø på den skårne øvre overflade. Sæt frøene i den vinkel, hvor den afskårne agaroverflade kommer i kontakt med petriskålsvæggen, så rødderne kan vokse imellem dem.

Luk petriskålene og forsegl dem med et åndbart tape for at muliggøre gasudveksling. Opbevar petriskålene i mørke ved fire grader Celsius i to dage til stratificering for at sikre synkroniseret og effektiv spiring. Placer derefter pladerne lodret i et stativ og dyrk planterne i et vækstkammer under lange dagsforhold.

Efter ni til 11 dage, når rødderne når infektionskanalen, skal du lægge pladerne vandret og åbne dem. Tilsæt derefter 500 mikroliter friskhøstede Verticillium conidia direkte i infektionskanalen. Forbered kontrolplader ved at tilsætte 500 mikroliter af en mock-opløsning i stedet for sporer.

Inkuber både kontrol- og sporeokulerede plader vandret, indtil væsken er gennemblødt. Luk derefter låget og forsegl pladerne med åndbart tape. Dæk roddelene med sorte papirkasser for at mørke rødder og jordbårne svampe.

Inkuber pladerne lodret i vækstkammeret. Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning. Steriliser først gennemsigtige 500 ml plastikkopper i 70 til 75% ethanolbad i 20 minutter.

Tør kopperne i lamina flowhætten. Hæld det autoklavede medium i plastikkopperne. Forbered et plastlag med fem præfabrikerede huller, et stort i midten og fire mindre i hvert hjørne.

Placer plastlaget på mediet, før det størkner. Skær agaren med en skalpel gennem det præfabrikerede midterhul til en dybde på ca. 1,5 centimeter. Fjern den afskårne agar for at skabe en infektionskanal for at tilføje svampesporerne senere.

Rids agarmediet lidt med en pipettespids i de fire mindre huller for at afbryde den størknede hud. Læg frøene ved hjælp af en pipettespids i de mindre huller. Luk plastikkoppen med en anden omvendt plastikkop og forsegl med åndbart tape.

Hold planterne ved fire grader Celsius i tre dage i mørket til stratificering. Derefter inkuberes kopsystemerne i vækstkammeret. For at inokulere plantlets med verticillium tilsættes en milliliter conidia-opløsning i infektionskanalen.

Til kontrol tilsættes en milliliter kimfri en fjerdedel MS-medium som en mock-opløsning. Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning. Bland først jord og sand grundigt i et tre til et volumetrisk forhold, hvilket letter vask af substratet fra rødderne senere.

Hæld blandingen i en autoklavepose og damp ved 80 grader Celsius i 20 minutter i en autoklave. Fyld potter med jord-sandblandingen og overfør dem til bakker. Tilsæt vand i bakkerne ca. en tredjedel af højden af en gryde til ensartet blødning af jord-sandblandingen.

Vandsprøjt blandingen for at sikre våde startforhold. Så tre til fire frø i hver gryde i tilstrækkelig afstand fra hinanden. Opbevar dem til stratificering ved fire grader Celsius i tre dage i mørket.

Lad frøplanterne vokse under lange dagsforhold med regelmæssig vanding, og vælg derefter planter af samme størrelse og alder for at udføre roddipokulationen. Tag jorden ud af potterne og udgrave rødderne. Vask forsigtigt rødderne i en vandbeholder og hold rosetterne ude af vandet.

Inkuber rødderne i 60 minutter i en petriskål indeholdende verticilliumsporeopløsningen eller mock-opløsningen. Forbered nye potter med fugtig dampsteriliseret jord uden sand. Brug en pipettespids til at lave et hul i midten af jorden i hver gryde.

Placer rødderne direkte i hullet og genopfyld hullerne forsigtigt med jord for at undgå yderligere belastning af planterne. Dyrk planterne under lange dagsforhold med regelmæssig vanding. Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning.

I det petriskålsbaserede system blev vellykket infektion af verticillium visualiseret i rødderne af arabidopsis. To dage efter podning blev markørgenet MYB51 stærkt induceret i inficerede rødder sammenlignet med kontrol, hvilket blev bekræftet ved QRTPCR-analyse. I det kopbaserede system blev der fundet en høj mængde svampe-DNA i bladene på inficerede planter, som grafen viser i forhold til mock-kontrol efter 12 dages podning.

QRTPCR-analyse viste beriget transkriptionsoverflod af markørgenet MYB51 i arabidopsis-rødderne. Ved hjælp af dette system blev verticillium podet til andre modelplantearter. Ved raps kunne svampe-DNA’et påvises i stammesegmenter skåret i bunden af kimplanterne 12 dage efter podning ved rødderne.

Svampe-DNA blev også påvist i tomatstængler, der indikerer formering af patogenet i planten. 21 dage efter podning ved hjælp af det jordbaserede system så rosetterne af mock behandlede arabidopsisplanter sunde og grønne ud, mens inficerede planter viste gullige eller nekrotiske blade og havde mindre grønt bladareal i forhold til mock, der indikerer vellykket infektion. Vær opmærksom, når du skærer infektionskanalen i petriskålssystemet for at forhindre agaren i at glide.

Ved at anvende det jordbaserede system må du ikke komprimere jorden omkring rødderne, mens du ompotter for at undgå yderligere stress på planterne. Efter rodpodning kan der f.eks. udføres patogene tests, analyse af genekspression, funktionel genomik eller agrokemiske tests, der giver ny indsigt i rodmikrobeinteraktioner og værktøjer til forbedring af landbruget.