Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Inokulasjonsstrategier for å infisere planterøtter med jordbårne mikroorganismer
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen presenterer en detaljert oppsummering av strategier for å inokulere planterøtter med jordbårne mikrober. Eksemplifisert for sopp Verticillium longisporum og Verticillium dahliae, er tre forskjellige rotinfeksjonssystemer beskrevet. Potensielle anvendelser og mulige nedstrømsanalyser fremheves, og fordeler eller ulemper diskuteres for hvert system.
Transcript
Selv om utallige mikrober koloniserer planterøtter, er disse interaksjonene vanskelige å analysere når de skjer under jorden. For å lette dette gir denne protokollsamlingen en oversikt over strategier for å inokulere planterøtter med jordbårne mikrober. Rotinokulering er grunnlaget for å studere rotmikrobeinteraksjoner, og ved å bruke følgende teknikker kan interaksjoner studeres på et molekylært, cytologisk eller histologisk nivå.
Vi forklarer tre inokulasjonssystemer som bruker verticillium som rotinvaderende mikrobe, og modellanlegget arabidopsis. Overføring av metodene til andre planter som tomat eller oljefrø voldtekt, og til andre rotmikrober, for eksempel gunstig serendipita, er imidlertid mulig. Forbered verticillium inoculum på forhånd ved å dyrke mycelia i PDB og indusere sporulering og Czapek dextrose kjøttkraft.
Begynn deretter med å helle det autoklavede mediet i Petri-retter. Etter herding av mediet, pakk Petri-rettene i en steril plastpose og oppbevar dem opp ned over natten i kjøleskapet ved fire til 10 grader Celsius. Klipp og fjern en infeksjonskanal i øvre tredjedel av det størknede mediet med en skalpell.
Unngå å få væske eller luft under agarmediet under kutting. Deretter bruker du en steril pipettespiss for å distribuere 50 til 100 overflatesteriliserte arabidopsisfrø på den kuttede øvre overflaten. Sett frøene i vinkelen der den kuttede agaroverflaten kommer i kontakt med Petri-parabolveggen slik at røttene kan vokse inn mellom dem.
Lukk Petri-rettene og forsegle dem med et pustende tape for å tillate gassutveksling. Hold Petri-rettene i mørket ved fire grader Celsius i to dager for stratifisering for å sikre synkronisert og effektiv spiring. Plasser deretter platene vertikalt i et stativ og vokse plantene i et vekstkammer under lange dagforhold.
Etter ni til 11 dager når røttene når infeksjonskanalen, legg platene horisontalt og åpne dem. Tilsett deretter 500 mikroliter nyhøst Verticillium-conidia direkte inn i infeksjonskanalen. Forbered kontrollplater ved å legge til 500 mikroliter av en spotteløsning i stedet for sporer.
Inkuber både kontroll- og sporeinokulerte plater horisontalt til væsken har gjennomvåt seg. Lukk deretter lokket og forsegle platene med pustende tape. Dekk rotdelene med svarte papirbokser for å mørke røtter og jordbåren sopp.
Inkuber platene vertikalt i vekstkammeret. Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering. Steriliser først gjennomsiktige 500 milliliter plastkopper i 70 til 75% etanolbad i 20 minutter.
Tørk koppene i lamina flow hetten. Hell det autoklavede mediet i plastkoppene. Forbered et plastlag med fem prefabrikkerte hull en stor i midten og fire mindre i hvert hjørne.
Plasser plastlaget på mediet før det størkner. Klipp agaren med en skalpell gjennom det prefabrikkerte senterhullet til en dybde på ca 1,5 centimeter. Fjern kuttet agar for å lage en infeksjonskanal for å legge til soppsporene senere.
Skrap agarmediet litt med en pipettespiss i de fire mindre hullene for å avbryte den størkne huden. Plasser frøene med en pipettespiss i de mindre hullene. Lukk plastkoppen med en ny invertert plastkopp og tetning med pustende tape.
Hold plantene på fire grader Celsius i tre dager i mørket for stratifisering. Inkuber deretter koppsystemene i vekstkammeret. For å inokulere planteler med verticillium, legg til en milliliter conidia-løsning i infeksjonskanalen.
For kontroller, legg til en milliliter bakteriefri en fjerde MS-medium som en mock løsning. Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering. Bland først jord og sand grundig i et tre til en volumetrisk forhold som letter vasking av substratet fra røttene senere.
Hell blandingen i en autoklavpose og damp ved 80 grader Celsius i 20 minutter i en autoklav. Fyll potter med jord-sandblandingen og overfør dem til skuffer. Tilsett vann i brettene omtrent en tredjedel av en grytehøyde for jevn bløtlegging av jordsandblandingen.
Vannsprøyte blandingen for å sikre våte startforhold. Så tre til fire frø i hver gryte i nok avstand fra hverandre. Hold dem for stratifisering ved fire grader Celsius i tre dager i mørket.
La plantene vokse under lange dagforhold med vanlig vanning, og velg deretter planter av lignende størrelse og alder for å utføre rotdippinokuleringen. Ta jorda ut av pottene og utgrav røttene. Vask røttene forsiktig i en vannbeholder og hold rosettene ute av vannet.
Inkuber røttene i 60 minutter i en Petri-tallerken som inneholder verticilliumsporløsningen eller spotteløsningen. Forbered nye potter med fuktig dampsterilisert jord uten sand. Bruk en pipettespiss for å lage et hull i midten av jorda i hver gryte.
Plasser røttene direkte inn i hullet og fyll hullene forsiktig med jord for å unngå ekstra stress for plantene. Dyrk plantene under lange dagforhold med vanlig vanning. Utfør analysene på de foretrukne tidspunktene etter inokulering.
I det Petri parabolbaserte systemet ble vellykket infeksjon av verticillium visualisert i røttene til arabidopsis. To dager etter inokulering ble markørgenet MYB51 sterkt indusert i infiserte røtter sammenlignet med kontroll, noe som ble bekreftet av QRTPCR-analyse. I det koppbaserte systemet ble det funnet en høy mengde sopp-DNA i bladene av infiserte planter som grafen viser i forhold til hånlig kontroll etter 12 dager med inokulasjon.
QRTPCR-analysen viste beriket transkripsjonsoverflod av markørgenet MYB51 i arabidopsisrøttene. Ved hjelp av dette systemet ble verticillium inokulert til andre modellplantearter. I oljefrø voldtekt var sopp-DNA detekterbart i stammesegmenter kuttet ved bunnen av plantene 12 dager etter inokulasjon ved røttene.
Sopp-DNA ble også påvist i tomatstammer som indikerer forplantning av patogenet i planten. 21 dager etter inokulering ved hjelp av det jordbaserte systemet, så rosettene av mockbehandlede arabidopsisplanter sunne og grønne ut mens infiserte planter viste gulaktige eller nekrotiske blader og hadde mindre grønt bladområde i forhold til spott som indikerer vellykket infeksjon. Vær oppmerksom når du kutter infeksjonskanalen i Petri-parabolen for å forhindre at agaren glir.
Påføring av det jordbaserte systemet, ikke komprimer jorda rundt røttene mens dupotterer for å unngå ytterligere stress på plantene. Etter rotinokulasjon kan for eksempel patogene tester, analyse av genuttrykk, funksjonell genomikk eller agrokjemiske tester utføres som gir ny innsikt i rotmikrobeinteraksjoner og verktøy for å forbedre landbruket.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
