Spänningsmätare Tether Probes för kvantifiering av tillväxtfaktormedierad integrinmekanik och vidhäftning

Detta protokoll är viktigt på grund av enkelheten hos TGT-sensorplattformen som används för att studera EGFR-integrin-överhörning och dess inflytande på cellens mekaniska krafter. Rao skisserade för att undersöka EGF-beroende reglering av cellmekanik. Protokollet är anpassningsbart för olika ligander, celltyper, stimuleringsparadigmer och kan kombineras med TGT med varierande spänningströsklar.

Ytsyntes kan verka skrämmande till en början. Nyckeln är att vara förberedd och organiserad för att exakt utföra de invecklade stegen genom att använda en checklista för reagensberedning och beräkningar. På dag ett, placera upp till åtta 25-millimeter glasskydd glider in i ett polytetrafluoretylenställ.

Placera stället i en 50-milliliter borosilikatbägare innehållande 40 ml 200-säker etanol. Ultraljudsbehandling vid en driftsfrekvens på 35 kilohertz i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Fyll en 50-ml bägare med 40 ml piranha-lösning som nyligen framställts genom att blanda svavelsyra och väteperoxid i ett förhållande 3: 1 i en Pyrex-bägare och rör om med en glaspipett.

Överför täckslipstället till bägaren och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i dragskåpet för att etsa lockets glidyta. Efter etsning, överför täckstället till en bägare med ultrarent vatten med pincett. Inspektera täckslipsarna visuellt för att säkerställa att ytorna ser rena ut utan mönster eller dammpartiklar på glasytan.

Överför täckstället till en bägare med 200-säker etanol och tvätta två gånger i 15 sekunder för att balansera ytor till organiskt lösningsmedel. Överför täckslipstället till 200-säker etanollösning med 3% APTES i en timme vid rumstemperatur för att silanisera täcksliparna. Sänk ner racket i en ren bägare med 200-säker etanollösning.

Torka locket glider med kvävgas med lågt utgångstryck. Placera locket i en 10 centimeter polystyrenskål med en bit parrafinfilm som ligger platt inuti den. Tillsätt 100 mikroliter av två milligram per milliliter NHS-biotinlösning i DMSO till fyra täckslips placerade på paraffinfilm.

Ställ en smörgås med de andra fyra täcksliporna ovanpå, med två täckslips vända mot varandra med funktionaliseringslösningen däremellan. På dag två, ta bort skålen från fyra grader Celsius och separera de inklämda täcksliporna. Undvik att repa eller skada den funktionaliserade ytan medan du separerar smörgåsen.

Orientera sedan locket glider i stället med den belagda ytan vänd mot varandra. Torka med kvävgas. Placera täcksliporna i en ny skål med en parrafinfilm inuti den.

Tillsätt 800 mikroliter 0,1% bovint serumalbumin i 1X PBS till varje täckblad. Inkubera täckglidningarna vid rumstemperatur i 30 minuter för att passivera ytan och blockera ospecifik bindning av efterföljande funktionaliseringsreagenser. För att funktionalisera täckglidningarna, tillsätt 800 mikroliter med ett mikrogram per milliliter streptavidin i 1X PBS vid rumstemperatur i 45 till 60 minuter.

Montera TGT-sonderna i ett PCR-rör med en termocykling. Efter inkubation, tvätta locket glider tre gånger med 1X PBS. Lägg till 100 mikroliter av de förmonterade TGT-sonderna till fyra täckslips och gör smörgåsar med de återstående fyra täcksliparna med den funktionaliserade sidan vänd mot sonderna.

Täck med aluminiumfolie. Efter inkubation, separera smörgåsarna och tvätta täckslipsarna med 1X PBS tre gånger. Montera försiktigt täcksliporna i förrenade bildkammare.

För att undersöka effekten av epidermal tillväxtfaktorstimulering på Cos-7-mekanik, vidhäftning och cellspridning, trypsinisera Cos-7-celler med 0,05% trypsin-EDTA i två minuter. Neutralisera trypsinet genom att tvätta med HBSS och centrifugera vid 800 G i fem minuter. Plattceller med en densitet av 40 000 celler på de monterade TGT-ytorna i DMEM kompletterat med 50 nanogram per milliliter EGF eller DMEM utan EGF.

Tvätta cellerna tre gånger med 1X PBS efter inkubation. Fixa med två milliliter 4% paraformaldehyd i 12 minuter vid rumstemperatur. Tvätta täckglidningarna fem gånger med 1X PBS med fem minuters mellanrum vid rumstemperatur.

Eventuellt kan du inkubera täckslipsarna med 50 millimolär ammoniumklorid i 1X PBS i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Lägg till buffert A och placera bildkamrarna med täckglidningar i en fuktbehållare. Inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius för att blockera och permeabilisera cellerna.

Späd den primära anti-paxillinantikroppen vid 1:250 utspädningar i blockerande buffert. Inkubera med 200 mikroliter primär antikroppslösning per täckglidning i två timmar vid 37 grader Celsius. Märk celler samtidigt med en blandning av dikonjugerad sekundär antikropp av get/kanin vid spädning 1:800 och dikonjugerat falloidin vid 1:400 utspädningar i 200 mikroliter blockerande buffert per täckglidning.

Tvätta ytorna fem gånger med 1X PBS med fem minuters mellanrum. För att börja, tillsätt olja till målet, rengör täckglidbotten i provkammaren och placera provet på scenen. Fokusera på en cell och engagera det perfekta fokuset.

Rikta in RICM genom att stänga och centrera epi-illumination-bländarens membran. Fokusera 488-nanometerlasern till en liten plats i taket på rummet och öka infallsvinkeln tills den passerar den kritiska vinkeln, samtidigt som du övervakar fluorescensen på kameran i ett live-läge. Observera en kraftig minskning av bakgrundsfluorescensen och ett enda fokusplan när den kritiska vinkeln överträffas.

Identifiera celler för avbildning med kamerans live-läge med RICM. Skaffa RICM- och TIRF-bilder av aktin vid 488-nanometer excitation, integrinspänning vid 561-nanometer excitation och paxillin vid 647-nanometer excitation. Hämta bilder sekventiellt med en exponeringstid på 200 millisekunder.

Byt omslagsglidningar, fokus och upprepa. Cos-7-celler pläterades på denna TGT-yta med eller utan EGF-stimulering för att studera effekten av EGFR-aktivering med ligandstimulering på integrinmekanik. Om ett integrin binder liganden och applicerar en kraft som är större än sondens spänningströskelsumma, kommer DNA-duplexen att separeras, vilket leder till fluorescens.

Varje TGT-sond som en mekanisk kraft inte har brutit kommer att förbli icke-fluorescerande. Cellerna inkuberades med eller utan EGF på TGT-ytorna i 60 minuter, fixerades och immunstifierades för att visa fokal vidhäftningsfördelning och organisationen av cytoskeletten. I RICM-bilden förbättrades Cos-7-cellspridningen på 56-piconewton TGT-ytan signifikant med EGF-stimulering jämfört med utan stimulering.

Stimulering med EGF resulterade i en mer cirkulär morfologi, som representerar Cos-7-cellspridning och växande. Fluorescensen från öppna sonder är också högre med EGF-stimulering, vilket observerats i spänningsfluorescensbilden. Den integrerade intensiteten hos öppna sonder som var proportionell mot antalet öppna sonder var mycket högre med EGF-stimulering än utan stimulering.

Kom alltid ihåg orienteringen av täckglidningarna och håll den funktionaliserade ytan uppåt. När du separerar smörgåsen, var försiktig så att ytan inte repas eller skadas. Efter ytsyntes kan man sondera för cytoplasmatiska proteiner som reglerar celladhesion eller mekanisk transduktion.

Detta möjliggör identifiering av nedströms signalmolekyler som är involverade i orkestrering av cellmekanik vid plasmamembranet.