Lett isolering av kjerner fra hjernevevet til voksen afrikansk turkis killifish, en naturlig kortvarig modell for aldringsforskning

Dette er den første optimaliserte protokollen for å isolere kjerner av høy kvalitet for enkeltkjernesekvenseringseksperimenter ved bruk av frosne hjerner av afrikansk turkis killifish, en fremvoksende vertebratmodell for aldringsforskning. Denne protokollen isolerer kjerner veldig forsiktig, noe som skiller den fra tøffere protokoller optimalisert for andre organismer med mer myeliniserte hjerner, noe som resulterer i nedbrytte kjerner når de brukes i killifish. Denne metoden vil være medvirkende til å hjelpe oss med å forstå hjernens aldring på enkeltcellenivå.

Det bør oversettes godt til andre vev som krever mer skånsom kjerneisolasjon. Denne protokollen er brukervennlig. Den mest krevende oppgaven er gradient sentrifugering for fjerning av rusk, der det er bedre å være treg og nøyaktig enn rask og rotete.

Demonstrere prosedyren vil være Ari Adler og Brian Teefy, en forskningslaboratorium tekniker og en postdoktor fra Benayoun laboratoriet. Etter å ha dissekert killifish, tine det frosne hjernevevet på is i 10 minutter og slå hjernen i en milliliter iskalde kjernelysisbuffer i en to milliliter dounce homogenisator. Mens du lyser prøven, hold homogenisatoren på is og unngå å generere bobler.

Dounce vevet som beskrevet i manuskriptet og la prøven hvile på is i dounce homogenisatoren i to minutter. Deretter siler du prøven gjennom et 70 mikrometer cellefilter til et 15 milliliter konisk rør forhåndsbelagt med 5% BSA. Tilsett fire milliliter kjernevaskbuffer til prøven ved å pipettere vaskebufferen over 70 mikrometer cellefilteret og bland ved å forsiktig invertere røret fem ganger.

Ved hjelp av en svingende bøtterotor, sentrifuger prøven ved 500 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten ved å helle den forsiktig i en flytende avfallsbeholder. Hold prøven loddrett og fjern den gjenværende vaskebufferen med en P1000-pipette.

Umiddelbart resuspend kjernene i en milliliter av kjerner vaske buffer med en bred bore P1000 pipette spissen. Deretter bringer du prøven til fem milliliter ved å legge til fire milliliter kjernevaskbuffer og bland som vist tidligere. Pellet cellen ved sentrifugering.

Kast supernatanten og resuspend kjernene i en milliliter kjernevaskbuffer med en bred borepipettespiss. Overfør nå kjernene til et flowcytometrirør. Tilsett 300 mikroliter ruskfjerningsløsning til cellesuspensjonen og bland den grundig ved pipettering med en bred borespiss til blandingen er homogen.

Hold røret i en liten vinkel, og legg forsiktig over en milliliter kjernevaskebuffer på toppen av kjerneløsningen ved hjelp av en P1000-pipette. Sentrifuger prøven i en svingende bøtte rotor ved 3000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast de to øverste fasene fullstendig med en P1000-pipette.

Overfør bunnlaget til et 15 milliliter konisk rør forhåndsbelagt med 5% BSA. Ta deretter volumet til 15 milliliter med kjernevaskebuffer og bland ved å invertere røret tre ganger. Sentrifuger røret ved 1000G i 10 minutter ved fire grader Celsius i en svingende bøtterotor.

Fjern supernatanten forsiktig og resuspender umiddelbart pelleten i 150 mikroliter kjernevaskebuffer ved hjelp av en bred borepipettespiss. Bytt til en standard borepipettespiss satt til 300 mikroliter. Pipetter hele prøven, og fest deretter et filter på 40 mikrometer på tuppen til enden av pipettespissen.

Filtrer prøven ved å tvinge prøven gjennom filteret til et lavt DNA-bindende, 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør. I et FACS-rør resuspenderer du 10 mikroliter av den filtrerte kjerneprøven i 90 mikroliter av den anbefalte flowcytometribufferen. Flekk prøvene med propidiumjodid ved en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter.

Når du har konfigurert arbeidsområdet som beskrevet i manuskriptet, starter du flyten ved å trykke på avspillingsikonet nederst til høyre. Se etter luftbobler eller klumper i prøven ved hjelp av sidespredningsområdet versus HDRT. Kontroller også sidespredningen versus fremoverspredningsplottet for å bekrefte at hendelsene akkumuleres innenfor vinduets grenser.

Hvis du vil ha en forstørret visning, dobbeltklikker du sidespredningsområdet i forhold til PerCP-Vio700-A-tegningen. Klikk på knappen øverst til venstre med en vinkelrett linje for å velge en kvadrantport. Klikk deretter hvor som helst i sidespredningsområdet kontra PerCP-Vio700-A-plottet, og kvadranter vises inne i plottet.

Klikk hvor som helst på kvadrantskillelinjene, og skyv markøren for å endre kvadrantplasseringen. Plasser kvadrantene slik at øvre venstre kvadrant inneholder rusk og øvre høyre kvadrant inneholder kjerner. Klikk på torget, grått, I-ikonet for å åpne egenskapsvinduet.

Gå til kategorien regionfunksjoner og sørg for et grønt merke ved siden av det øverste elementet, som indikerer at hele plottet er valgt. Under funksjonslisten klikker du på antall per mikroliter for å produsere et grønt merke. Klikk på OK, og hver kvadrant vil vise en telling per mikroliter metrisk.

Velg antall og prosent totalt fra kategorien områdefunksjoner for å vise råtall og prosenter om ønskelig. Tegn en mangekantet port rundt denne populasjonen ved å klikke mangekantknappen øverst til venstre på verktøylinjen. Klikk deretter en gang og skyv musen for å tegne et lineært segment av porten.

Klikk igjen for å fullføre og begynne på den neste, etterfulgt av et dobbeltklikk for å fullføre porten. Klikk på kanten av porten og skyv musen for å flytte porten. Klikk på hjørnene til porten for å endre formen, og teller per mikroliter av den inngjerdede befolkningen vises.

Sunne kjerner som dukket opp som singletkjerner med intakte membraner er egnet for nedstrøms analyse. Imidlertid er usunne kjerner preget av skadede kjernemembraner, noe som fører til kjerneklumping og kan bidra til bakgrunnssignaler i nedstrøms applikasjoner. Kjerner er i singlet- og multipletformer i øvre høyre kvadrant, med singlets som den laveste skyen av hendelser etterfulgt av dubletter og trillinger i stigende rekkefølge.

Rusk er preget av hendelser i de to venstre kvadrantene i et lavkvalitets kjernepreparat der ruskfjerningstrinnet ble utelatt. Rusk utgjør mer enn 40% av hendelsene. Men i et eksperiment av høy kvalitet utgjør rusk mindre enn 15% av alle hendelsene.

Det er viktig å fjerne mellomlaget helt etter sentrifugeringstrinnet for fjerning av rusk for å redusere forurensende bakgrunn RNA Nuclei isolert ved hjelp av denne protokollen kan brukes til enkeltkjerner RNA-sekvensering eller ATAC-sekvensering for å oppnå transskriptomisk og epigenetisk informasjon på enkeltcellenivå. Denne teknikken vil tillate forskere å utforske hjernens genregulering på enkeltcellenivå i den afrikanske turkise killifish, en naturlig kortvarig vertebrat modellorganisme for aldringsforskning.