Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
בידוד וקטורי ריפוי גנטי מהדור הבא באמצעות הנדסה, ברקוד וסינון של גרסאות קפסיד הקשורות לנגיף אדנו (AAV)
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
יצירת ספריית תצוגה פפטידית AAV ותיקוף לאחר מכן באמצעות ברקוד של מועמדים עם תכונות חדשות ליצירת AAV מהדור הבא.
Transcript
פרוטוקול זה סוגר פער משמעותי בין האבולוציה הטבעית של נגיפים לבין השימוש בהם כווקטורים רקומביננטיים לטיפול גנטי אנושי בכך שהוא מאפשר את הנדסאתם, גיוון וריבודם. טכניקה זו מאפשרת סינון מקבילי בתפוקה גבוהה עבור וירוסים חדשניים, מבודדים או מהונדסים הקשורים לאדנו, בקיצור AAV, וריאנטים, ובכך חוסכת במספר בעלי חיים, עבודה, עלות וזמן. גרסאות הקפסיד AVV שזוהו יכולות להגביר את היעילות והספציפיות של העברה מבוססת AAV של טרנסגנים טיפוליים, ובכך להפחית את המינון הנגיפי הנדרש.
זה יכול לשפר את הבטיחות ואת הישימות של ריפוי גנטי. אותה גישה יכולה לשמש גם להנדסה קפסידית או מקדמת של כלי העברת גנים אחרים, מה שמשפר את הבנתנו את הביולוגיה שלהם ואת השימוש בהם בריפוי גנטי. מי שיסייעו להדגים את ההליך יהיו הדוקטורנטים ג'ונאס בקר וג'ישין ליו, הפוסט-דוקטורנטיות ג'ואנה שומסקה ומרגריטה זיאס, כמו גם עוזרות המחקר אמה גרסטמן ואלן וידטקה מהמעבדה שלי.
התחל בניתוח נתוני ריצוף NGS עם Python 3 ו- Biopython. ניתוח NGS מורכב משני שלבים. בשלב הראשון, חפש בקובצי הרצפים רצפים העונים על קריטריונים ספציפיים, כגון איגוף רצפים, אורך ומיקום באמצעות סקריפט אחד, וקובץ תצורה המספק את המידע הדרוש.
עבור השלב השני, תרגם את הרצפים שחולצו החל מרצף AGWGGC באמצעות סקריפט מספר שתיים והתצורה ו- zuordnung. קובצי TXT המספקים את המידע הדרוש. הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים.
העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את Python ואת קבצי התצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני הפעלת הסקריפטים, פתח את zuordnung.
קובץ TXT והוספת שתי עמודות המופרדות באמצעות טאבים. הזן את שמות קובצי Gzip בעמודה הראשונה ואת השם הסופי הרצוי בעמודה השנייה. שנה את המשתנים בקובץ התצורה כמתואר בכתב היד של הטקסט.
באמצעות הפקודה הספציפית, התחל את זיהוי רצף הווריאנטים וחילוץ. הפלט יהיה קבצי TXT עם רצפי הדנ"א שחולצו ומספר הקריאות שלהם. כותרת הקובץ מכילה נתונים סטטיסטיים ונתונים אלה יועברו לקבצים הבאים.
נתוני TXT אלה יהיו קובץ הקלט עבור סקריפט מספר שתיים שבו רצפי הדנ"א מתורגמים, מדורגים ומנותחים. באמצעות הפקודה הספציפית, התחל תרגום PV וניתוח של קבצי פלט הטקסט של סקריפט אחד כמתואר בכתב היד של הטקסט. קבצי הפלט של סקריפט מספר שתיים ייקראו באמצעות העמודה השנייה של טבלת בדיקת המידע ב- zuordnung.
TXT עם הרחבות המבוססות על סוג הניתוח. ודא ששלושת קובצי הפלט כוללים נתונים סטטיסטיים בשורות הראשונות ועמודה ראשונה עם האינדקס של כל רצף DNA מקובצי הטקסט שהוקלטו. שאר העמודות צריכות לכלול את רצף הדנ"א, מספר הקריאות, קריאה קדימה או אחורה ורצף פפטידי מתורגם.
הרצפים הלא חוקיים צריכים לכלול NA ולא חוקיים בשתי העמודות האחרונות. הצג באופן חזותי את קבצי הפלט באמצעות תוכנה זמינה המבוססת על צרכי המשתמש. כדי לבצע את ניתוח נתוני רצף ה- NGS באמצעות קוד מותאם אישית בפייתון 3, זרימת העבודה כוללת זיהוי רצפי ברקוד מונחה על ידי רצפי איגוף, אורכם ומיקומם, כמו גם ניתוח העשרת ברקוד ופיזור על פני קבוצת הרקמות.
הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים. העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את קבצי הפיתון והתצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לפני הפעלת הסקריפט, צור שני קובצי טקסט מופרדים בטאבים:capsidvariance. קובץ txt עם רצפי הברקוד שהוקצו לשמות וריאנטים של AAV capsid, והזיהום. קובץ TXT עם רצפי ברקוד שמקורם בזיהום אפשרי.
לבסוף, ערוך את קובץ התצורה כך שיכלול את פרטי הנתיב לתיקייה עם נתוני רצף, רצף אזורי איגוף של הברקודים, מיקומם וגודל החלון לזיהוי ברקוד. הפעל את סקריפט זיהוי הברקוד עם הנתיבים וקבצי התצורה שסופקו באמצעות הפקודה המתאימה. הפלט של ביצוע פקודה זו יהיה קבצי TXT עם ספירות חוזרות לכל וריאנט capsid ואת המספר הכולל של קריאות ששוחזרו מהנתונים הגולמיים.
כדי להעריך את ההתפלגות של קפסיד AAV ברקודי בין רקמות או איברים, ב zuordnung. קובץ TXT, הקצה את השם של כל קובץ טקסט המתקבל מהפעלת זיהוי הברקוד לשם רקמה או איבר. הוסף את שמות קובצי הטקסט בעמודה הראשונה ואת שמות הרקמות או האיברים המתאימים במשימה המופרדת באמצעות טאבים.
צור איבר. קובץ TXT עם רשימת השמות עבור איברים מופעלים ומחוצה לו, המתאימים לשמות שניתנו בהקצאה Zuordnung. קובץ txt.
לאחר מכן צרו normalization_organ. TXT ו- normalization_variant. קובצי טקסט מופרדים באמצעות כרטיסיות TXT עם ערכים מנורמלים עבור כל גרסאות Capsid וכל האיברים והרקמות.
בעמודה הראשונה עם normalization_organ. קובץ txt, כתוב את השמות שניתנו עבור כל איבר, ואת העמודה השנייה עם ערכי נורמליזציה עבור הרקמה המתאימה. מלא את העמודה הראשונה של normalization_variant.
קובץ TXT עם רשימת שמות Capsid, והעמודה השניה עם הערכים המנורמלים של ספירות הקריאה עבור כל Capsid בספריה המאוגמת. ערוך את קובץ התצורה על-ידי ציון הנתיבים המלאים לכל הקבצים הנוספים והפעל את סקריפט ניתוח הברקוד באמצעות פקודה ספציפית זו. סקריפט ניתוח הברקוד מפיק מספר קבצים, כגון קובצי טקסט עם ריכוז יחסי או ערכי RC של התפלגות קפסיד ברקמות שונות, בהתבסס על שלבי נורמליזציה מרובים שתוארו קודם לכן, וקובץ הגיליון האלקטרוני המשלב נתוני קובץ טקסט לנתוני מטריצה ממוזגים.
הצג את הנתונים באופן חזותי ובצע ניתוח אשכולות של נתוני המטריצה כמתואר בכתב היד של הטקסט. התסריט יזין את הריכוז היחסי. XLS קבצים וליצור שתי חלקות של מפת חום אשכול היררכית וניתוח רכיבים עיקריים.
כדי לשנות תרשימים או פרמטרים של PNG, פתח את הסקריפט R ופעל לפי ההוראות בסעיף ההערות. האזורים המכומתים של הגן AAV2 rep הראו כי 99.2% היו חיוביים עבור ITR, דבר המצביע על כך שהקפסידים של AAV הכילו את כל הגנום הנגיפי. בכל שלוש הקבוצות, הקריאות שחולצו בהתבסס על רצפי חתימות ספציפיים לספרייה ייצגו כ-94% מכלל הקריאות, מה שמצביע על איכות טובה.
מתוכם, יותר מ-99% היו קריאות PV תקפות ויותר מ-99% מהקריאות הפוטו-וולטאיות התקפות היו ייחודיות, מה שמרמז על כך שהספרייה הייתה מאוזנת עם מגוון פנימי גבוה. שני הענפים העיקריים בהיררכיית מפת החום שיקפו את ההבדל ביעילות ההולכה של גרסאות קפסיד. הענף השמאלי עם רוב גרסאות הקפסיד כלל את כל הקפסידים שהראו ערך ריכוז יחסי גבוה ברוב הרקמות.
מלבד סגוליות גבוהה להפליא של הכבד, שלושה קפסידים אחרים הפגינו ספציפיות בסרעפת, בשרירי השלד, בשרירי הזרוע ובמוח. הענף הימני של האשכולות ההיררכיים כלל את גרסאות הקפסיד עם יעילות התמרה נמוכה יותר, הניכרת ביותר בתריסריון ובלבלב. ניתוח המרכיבים העיקרי עבור תת-הקבוצה המקורית יוצר את אשכול גרסאות הקפסיד עם ספציפיות גבוהה של הכבד ומתאר את טרופיזם השרירים המצטיין של VAR60.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, עליך לשים לב לשגיאות הקלדה. התחביר שונה גם אם אתה משתמש בשורת הפקודה של Windows בהשוואה ל- Linux. לאחר זיהוי וריאנטים חדשים של AAV, יש לאמת את הפוטנציאל הטיפולי והתרגומי במודל של בעלי חיים שנפטרו או גדולים יותר.
טכניקה זו מאפשרת השוואה ישירה זה לצד זה של גרסאות AAV בתנאים זהים והיא ורסטילית ביותר, וסוללת את הדרך לתרגומה בבעלי חיים גדולים, או אפילו בבני אדם.
Tags
ביו-הנדסה גיליון 188 AAV ספריות AAV הנדסת קפסיד תרפיה גנטית סינון בתפוקה גבוהה NGS ספריות ברקודRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
