Мышь надпочечников сотовый хромаффинных Изоляция

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kolski-Andreaco, A., Cai, H., Currle, D. S., Chandy, K. G., Chow, R. H. Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation. J. Vis. Exp. (2), e129, doi:10.3791/129 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.

Protocol

Сокращения:
РДЦ - надпочечников хромаффинных клеток, Е. Soln - раствор фермента, Е. DMEM - Обогащенный Дульбеко изменения Eagle среднего

  1. Подготовка
    1. Добавить папаин, чтобы желаемое количество E. Soln (40 единиц папаин / 1 мл Е. Soln.).
    2. Активировать папаин с карбогена в течение приблизительно 15 минут на льду. Кислородом Локка буфера на льду, а также.
  2. Рассечение
    1. Используйте 8-10 недель мыши.
    2. До пищеварения удалить кислородом буфера Локка и место на льду.
    3. Смотрите видео для вскрытия процедуры.
    4. Как только вырезали, место желез кислородом буфера Локка.
  3. Подготовка железы
    1. Удаление жира из железа.
    2. Газа коры из железа.
  4. Ферментативного пищеварения
    1. Стерильный фильтр кислородом папаин.
    2. Сделайте четыре бассейна кислородом папаин на чашке Петри.
      1. 3 бассейна должна быть около 100uls.
      2. 1 из бассейнов должна быть около 400uls.
    3. Вымойте medullae через бассейны
      1. С 1 по 3 100 мкл бассейнов.
      2. Затем через 400ul бассейн
      3. Pippette 300ul Е. Soln и мозгового вещества отрывки из 400ul бассейн в микроцентрифужную трубки.
      4. Qrap парафильмом и отцентрифугировать трубки и места в 37 ° С на водяной бане 20 минут.
      5. Помните продолжать кислородом оставшиеся Е. Soln содержащие папаин.
      6. Через 20 минут стерильный фильтр более Е. Soln.
      7. Замените старые Е. Soln купания medullae с вновь фильтруются Е. Soln.
  5. Triturations
    1. Аспирацию и отбросить Е. Soln.
    2. Вымойте medullae в 1 мл Е. DMEM.
    3. Аспирацию и отбросить Е. DMEM.
    4. Добавить 300ul Е. DMEM и растирают с 20-кратным 1мл чаевые.
    5. Вырезать 200ul кончик стерильным лезвием бритвы.
    6. Измельченного в порошок 5-10X с вырезом наконечник 200ul.
    7. Отменить Е. DMEM части купания medullae. Средний будет содержать мусор.
    8. Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
    9. Растирают с 200ul наконечник 20x
    10. Pippette Е. DMEM к микроцентрифужную трубки withough medullae штук. Средний будет содержать свободный РДЦ.
    11. Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
    12. Измельченного в порошок medullae с 23,5 калибр иглы шприца 20x.
    13. Комбинат Е. DMEM с обеих triturations. Medullae частей не должна присутствовать и должны теперь иметь featherlike внешний вид.
  6. Обшивка
    1. Микроцентрифужную Е. DMEM из последних двух растиранием шаги по 2,5 минуты на 3.7g s.
    2. Ресуспендируют пеллет в 50uls-200 Е. DMEM, в зависимости от последующих экспериментах.
    3. Пластина 10-30uls на покровное стекло.
    4. Подождите 15 минут для клеток придерживаться.
    5. Добавить 750uls Е. DMEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 27, 2007 - 11:27 AM
  2. Nice and clear video! What is the reason that the Locke's has to be oxygenated? In 4.1 you talk about oxygenated papain, dŒ you mean here (and in other points) carbonated? Can the E. Soln also be buffered with Hepes, why dŒs it has to be carbonated? Thanks in advance!   Cheers, Tony

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2008 - 8:24 AM
  3. I would like appreciated receiving the protocols to obtain adrenal chromaphin cells

    Reply
    Posted by: Asunción C.
    April 29, 2013 - 9:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics