一个型号的不安流致动脉粥样硬化小鼠颈动脉部分结扎术和颈动脉内皮细胞的RNA分离的简单方法

Medicine

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Summary

这描述了一个局部的颈动脉结扎手术,这会导致不安的水流条件和随后的动脉粥样硬化的发展(在两个星期)intraplaque新生血管在小鼠左颈总动脉(在四个星期内)。我们还描述了一个新颖的RNA从颈动脉内膜隔离方法,提供高纯度的内皮细胞的RNA。

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Nam, D., Ni, C., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D. G., Giddens, D. P., Jo, H. A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium. J. Vis. Exp. (40), e1861, doi:10.3791/1861 (2010).

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Abstract

尽管众所周知的密切联系,不安流连接到动脉粥样硬化的直接证据,一直缺乏。最近,我们使用修改后的版本的颈动脉部分结扎方法[1,2]表明它敏锐地诱导低,振荡流的条件下,在小鼠左颈总动脉不安流的两个关键特征。使用这个模型,我们提供了直接证据,扰乱流量确实在载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的发展快速,稳健的[3]。我们还开发了高纯度的内皮细胞RNA制备方法,从小鼠颈动脉内膜[3]。利用这种小鼠模型和方法,我们发现,部分结扎血管内皮功能障碍,导致在一个星期稳健,快速的在两个星期的动脉粥样硬化的形成在高脂血症小鼠模型以及复杂的病变,如intraplaque新生血管形成的功能,四个星期。这种快速

Protocol

1。部分结扎左侧颈内动脉

  1. 〜8周龄小鼠。建议至少18克的老鼠的重量。
  2. 30秒珠仪器灭菌消毒文书,并允许降温
  3. 诱导麻醉与氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(按10mg/kg)腹腔(IP)注射或替代麻醉IACUC批准。腹腔注射,注入鼠标在左侧腹部低象限。
  4. 将鼠标放置在变暖,直至完全麻醉室。确认与脚趾捏的麻醉深度。
  5. 将鼠标在手术阶段,在仰卧(腹朝上)位置。磁带脱颖而出爪子掌心向上和后肢爪子唯一下降的阶段。
  6. 脱毛剂的自由主义(例如奈尔)下颌骨和胸骨之间的颈部。轻轻按摩,直到所有的头发被删除。
  7. 清洁脱毛剂和优碘自由主义申请depilated面积。
  8. 准备1英寸长的路段为结扎6-0丝线缝合。每个鼠标需要两片缝合。
  9. 使用锋利的小剪刀,在颈部中间的4 - 6mm的纵切口。皮肤和底层筋膜需要削减。
  10. 移动左腮腺从中线的左侧,并开始直言不讳地剖析恰到好处的气管。您应该能够很容易识别脉动左颈。
  11. 按照颈尾端,直到你找到分叉。
  12. 坦率地剖析揭露以下四个远端分支关闭左颈总动脉:颈外动脉,颈内动脉,枕动脉,甲状腺上动脉的分叉。这些船只,特别是甲状腺,可以是脆弱的。必须非常小心你的夹层。
  13. 领带上述优越的使用6-0丝线缝合甲状腺颈外。要做到这一点,通过下面的动脉之一钳,抢了一块预切缝合与您其他钳的帮助。轻轻拉出缝线通过下面的动脉。领带坚决避免陷入结周围的任何组织。如果配合低于起飞甲状腺上动脉,你将有效地执行了一个完整的结扎,这是一个大大不同的模型的过程结束。
  14. 配合一个使用相同的技术结的颈内动脉和枕动脉。
  15. 验证缝合和甲状腺上动脉通畅的位置。
  16. 近似​​的皮肤和密切皮肤使用少量的组织MEND。
  17. 在气候变暖,直到恢复室放置老鼠。恢复通常需要30到60分钟。
  18. 一个单剂量丁丙诺啡(为0.1mg/kg),应立即进行管理,如果使用麻醉不提供长期缓解疼痛(即吸入异氟醚),或者如果动物处于困境的第一个24小时内手术后。在我们的经验,氯胺酮剂量麻醉管理由经验丰富的外科医生进行手术时,并没有进一步的镇痛需要提供足够的镇痛。

2。颈动脉超声检查

  1. 验证是否流部分结扎引起的不安,颈动脉流有一天结扎后应检查
  2. 异氟醚麻醉诱导 - 如果需要的话,可用于麻醉诱导箱
  3. 成像阶段,肚皮朝上放置在麻醉小鼠
  4. 磁带的胳膊和腿心电图传感器成像阶段
  5. 落叶颈部由奈尔自由主义的应用程序(如果不是已经做结扎过程只需要这一步)
  6. 插入直肠温度计温度记录
  7. 应用凝胶回声颈部
  8. 在B模式开始。
  9. 成像平面应该是90度(在探头上的旋钮应指向鼠标鼻子)
  10. 降低探测到鼠标的脖子,直到获得图像。
  11. 操作阶段,左,右,直到气管中线结构确定
  12. 确定左颈总动脉
  13. 倾斜成像阶段,这样一个角度成像平面和颈动脉之间产生。这个角度更大,更强的多普勒信号会。
  14. 广场脉冲多普勒左颈中。
  15. 根据需要,使用角度校正。
  16. 右侧颈总重复的测量。
  17. 成功的部分颈动脉结扎会导致整体左颈总流量减少(80-90%)与右侧相比,在舒张期对主动脉口的流动逆转。
  18. 一旦已取得令人满意的图像,关闭麻醉,擦拭ECHO OFF小鼠和自由的老鼠从磁带RES凝胶traints。将小鼠在回暖复苏室。

3。从颈动脉内膜RNA分离

  1. 牺牲小鼠CO 2吸入根据机构IACUC协议
  2. 磁带的爪子纸巾。
  3. 剪下的鼠标从腹部到胸部上方的皮肤。
  4. 打开腹壁下面的胸腔,用锋利的剪刀。
  5. 用镊子提起胸骨和削减隔膜,再切了胸腔,暴露心脏。
  6. 用剪刀剪开下腔静脉。
  7. 灌注压力(120毫米汞柱)为2至3分钟,正常的左心室通过含有10单位/ ml肝素生理盐水,直到肺部和肝脏变得苍白。
  8. 切开颈部皮肤,去除的脂肪,肌肉,和结缔组织,直到颈动脉暴露。
  9. 鼠标放置在解剖显微镜下。
  10. 穿刺孔下方在第二灌注左侧颈内动脉结扎网站。
  11. 压力灌注,再通过左心室正常含10单位/ ml肝素生理盐水,确保左侧颈细读〜1分钟。
  12. 用细尖镊子和小弹簧剪刀,小心地取出城郊周围的颈动脉外膜组织。要小心,不要挤压或伸展的颈动脉,在此清洗步骤。
  13. 剪下的左侧颈内动脉,主动脉弓和颈动脉分叉处以上的结扎点之间。
  14. 切的右颈总动脉,右锁骨下动脉分支点和颈动脉分叉处之间。
  15. 颈动脉为35 mm培养皿中,含冰冷的HBSS。如果需要的话,请小心取出任何剩余的外膜周围组织。
  16. 每个颈充盈每150μLQIAsol的细胞裂解液(QIAGEN),准备与29克针胰岛素注射器(3 / 10 ml注射器)。
  17. 小心颈的一端插入针头。
  18. 按住颈动脉和针尖与镊子,迅速(约1秒)刷新成1.5毫升管QIAsol裂解液(150μL)(内膜洗脱液)。
  19. 冲洗颈吃剩的(媒体+外膜)曾经在HBSS中,把1.5毫升管,并在液氮快速冻结。
  20. 内膜洗脱液和冷冻剩然后用内膜或媒体+外膜的RNA使用miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen)根据制造商的指示隔离。

4。代表性的成果:

我们部分结扎鼠标左键进行颈动脉超声检查,有一天,下面的过程。正如图1所示,成功的部分结扎减少血流速度和逆转的左颈总动脉在舒张期流量(不安流)。伴随着高脂肪食物的ApoE基因敲除(KO)的小鼠局部结扎诱导的左颈总动脉(LCA)的强劲动脉粥样硬化,但不能在对侧的右颈,两周(图2)。从颈动脉内膜收集RNA含有内皮标记基因,如PECAM - 1,而内侧平滑肌细胞标记基因,如A - SMA(图3)。

图1
图1:颈动脉解剖和结扎示意图: 结扎左颈总动脉的三个分支(LCA),颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA),枕动脉(OA)],而留下的甲状腺上动脉(STA)的开放。

图2
图2:超声图像显示流速剖面,揭示部分结扎诱导LCA在舒张期流动逆转(用箭头表示)。在RCA的流量保持不变结扎后。

图3
图3:部分结扎和高脂肪的饮食的ApoE基因KO小鼠的生命周期,迅速 ​​引起动脉粥样硬化的ApoE基因KO小鼠部分结扎和美联储1至3周的高脂肪的饮食。从LCA的冰冻切片油红- O染色。

图4
图4。内膜RNA制备方法。内膜的RNA和内侧+外膜(M +)RNA假手术RCA和LCA在C57BL / 6小鼠。 PECAM - 1和α- SMA的使用作为内部控制的18S RNA的分析,半定量RT - PCR 技术(A)和定量PCR(B,C) 。条形图平均± SEM,N = 3。

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Discussion

在此过程中,适当的识别所有常见的颈动脉分支,包括颈外动脉,颈内动脉,枕动脉,甲状腺上动脉是必不可少的。同样重要的是,以验证使用超声作为证明的流动模式。在我们经验丰富的的手中,我们的部分结扎手术的成功率超过500小鼠的超声研究为基础,超过90%。对于颈动脉内膜RNA的准备工作是很重要要注意的颈内动脉后出现的第一灌注步骤。流在这一点上左侧颈总动脉堵塞,如果有证据,我们建议不使用这些样本作进一步分析。

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Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院拨款HL87012“(HJ),HL75209”(HJ),UO1HL80711(DH,DG HJ)和世界一流大学项目“(HJ)的资金从韩国的科学,技术和教育部的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride) Baxter Internationl Inc. 2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) Tyco Healthcare, Covidien 8881600145
HBSS Cellgro 21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol) Qiagen 217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System VisualSonics, inc. a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice or similar system
6-0 Silk Suture, sterile Covidien s-1172 c2
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5675 or similar
Dissecting Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5005 or similar
Tissue Mend II Webster Veterinary 07-856-7946

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References

  1. Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23, (12), 2185-2191 (2003).
  2. Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22, (7), 1100-1105 (2002).
  3. Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297, (4), H1535-H1543 (2009).

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