Органотипической культуры взрослых сетчатки кролика

Published 4/29/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

В этой статье показано вскрытие и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки.

Cite this Article

Copy Citation

Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina. J. Vis. Exp. (3), e190, doi:10.3791/190 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Органотипической системы культуры функциональных нервных тканей являются важными инструментами в нейробиологических исследований. В идеале такая система должна быть совместима с методов визуализации, генетические манипуляции, и электрофизиологические записи. Здесь мы приведем простой межфазной культуры тканей система для взрослых сетчатки кролика, что не требует никакого специального оборудования и минимального обслуживания. Мы показываем, рассечение и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки. Кролик сетчатки культурный таким образом, может быть поддержана в течение 6 дней с очень небольшим изменением общей структуре анатомических или морфологии отдельных ганглиев и amacrine клеток.

Protocol

Создание генной пушки пулями (GOLD)

  1. Сделать 100X ПВП (0.5mg/ml) в 100% этанола.
  2. Взвесьте из 30 мг BioRad 1,6 золота Micron микроносителей и поместить его в трубку 1,5 мл Eppendorf.
  3. Рассчитать количество плазмиды, необходимых для получения концентрации 0,5-3 мкг плазмиды / мг золота, и место плазмиды в трубке с золотым микроносителях. Комбинат несколько плазмид, если необходимо.
  4. Довести объем плазмиды до 100 мкл дистиллированной воды.
  5. Добавить 100 мкл 0,05 М спермидина в трубку. Вихревые трубки 30 секунд.
  6. Vortex 1 минуты на полной скорости. Разрушать ультразвуком в течение 3-5 минут ..
  7. Сухой соответствующей длины Tefzel труб в аппарате Biorad PDS-1000/He течение 15 минут.
  8. После обработки ультразвуком, вихревые в течение 1-2 минут на полной скорости. Снизить скорость медленно, чтобы трубка будет открыт в то время как вортексе.
  9. Добавить 100 мкл 1 М CaCl 2 медленно трубки капля в то время как мудрые вортексе.
  10. Оставьте трубки при комнатной температуре в течение 10 минут.
  11. Сделайте 5 микрон фильтр.
    1. Возьмите два 5 мл шприца без иглы.
    2. Удалите поршень, и отделить черные шапки. Принимая маленькие ножницы, отрезали часть черной кепке, чтобы дать кольцо. Повторите с другой поршень с чистым два кольца.
    3. Сэндвич 5 микрон (мелкие детали, Inc нейлоновый фильтр, ½ дюйма в диаметре) фильтр между двумя кольцами, и нажимаем бутерброд на кончике шприца.
    4. Мотаться через шприц 50 мл коническую колбу.
  12. Через 10 минут, вихревые трубки в течение 30 секунд.
  13. Центрифуга трубку в течение 30 секунд и сохранить гранул.
  14. Добавить 1 мл 100% этанола для осаждения. Использование пипетки, чтобы разбить гранул, и вихрь 30 секунд. Спиновые 30 секунд и снять этанола. Повторить еще 2 раза.
  15. Добавить 1 мл 100% этанола в гранулах (перерыв с наконечником). Место это в 5 микрон фильтр и дайте ему течь через под действием силы тяжести в 50 мл коническую трубку. Используйте больше этанола, сколько необходимо для промыть трубы или помочь с потоком до конца.
  16. Спиновые 50мл трубки при 2000 оборотов в минуту в центрифуге в течение 5-10 минут. Удалить супернатант, за исключением гранул.
  17. В зависимости от желаемой плотности микроносителях необходимо, добавьте 800μl-1,5 мл 100% этанола и соответствующих 8 мкл-15 мкл раствора ПВП.
  18. Swirl и сразу же пойти в аппарате PDS-1000/He Biorad.
  19. Biorad PDS-1000/He аппарата
    1. Отсоедините трубку, соединяющую бак N2 газа в трубке сушки
    2. Выньте сушки Tefzel трубы от машины
    3. Вставьте один конец в 50 мл коническую трубку, и присоединить шприц к другому концу трубы. Соси коричневого шлама в середине трубы.
    4. Вставьте трубку обратно в машину.
    5. Wait (без вращения) в течение 4 минут
    6. После 4-х минут, отсасывать этанола медленно и осторожно, стараясь не нарушить микроносителях.
    7. Поворот трубы на 1 минуту.
    8. Через 1 минуту подключения трубки, соединяющей N 2 бензобак в сушильную трубку и пусть трубы высохнуть в течение 15 минут.
  20. Через 15 минут, разрезать трубы, чтобы пуля размер будет использоваться сразу или хранить при температуре 4 ° С в эксикаторе. Пули могут храниться до 3 месяцев.

Подготовка генной пушки

  1. Место пули в картридже. Каждая часть сетчатки могут быть сняты с 1-3 пуль.
  2. Вставьте картридж в генной пушки и прикрепить пистолет к гелия источник. Установить давление до 110 пси.

Подготовка средств массовой информации

  1. Препарирование среда

    1 бутылка Эймс решение (Sigma, 8.8g)
    1,9 г натрия гидрокарбоната
    10 мл 1% пера / стрептококк / L-глютамин (1:100) (Gibco / Invitrogen)
    990 мл дистиллированной водой до 1 л
    -------------------------------
    1 литр


  2. Фильтры рассечение среды с использованием 0,22 мкм фильтр.
  3. Инкубационный среде (500 мл)

    485 мл с фильтром СМИ рассечение
    5 мл 1% N2 дополнения (Gibco / Invitrogen)
    10 мл 1% лошадиной сыворотки (Sigma)
    500 мкл фенола красного
    -------------------------------------------------- -
    0,5 л


  4. Фильтры среду инкубации использованием 0,22 мкм фильтр.
  5. Bubble O 2 в среде рассечение в течение 15 минут перед началом протокола сетчатки уборки урожая.

Подготовка инкубации камеры для сетчатки

  1. Под капотом, заполнить несколько 60 мм в глубину блюда (инкубационный камер, Nunc) с 25 мл инкубационной среды. Количество блюд зависит от числа отставкеInAs необходимости.
  2. Место фильтр стоять в каждую глубокую тарелку. Только самые кончики стоять не должен быть погружен в воду.
  3. Поместите все глубокие блюда в инкубаторе до сетчатки готовы.
  4. Заполните два 100 мм чашки Петри и довести до вскрытия скамейке.

Подготовка кролика сетчатки

  1. Жертва кролика в соответствии с установленными протоколами. Следующие не должна быть выполнена под капотом.
  2. С угловыми ножницами, вставьте его за глаза в глазнице из кролика, резка оболочки и зрительного нерва, которые прикреплены к глазу.
  3. Аккуратно выньте глаз и промойте его кислородом СМИ рассечение.
  4. Место глаза (роговица вверх) в колодец глаз резки и закрыть крышкой.
  5. Место лезвием горизонтально прямо под крышкой. В одном движении, рисовать лезвием поперек глаз, чтобы отрезать роговицы, в результате чего глаз чашку.
  6. Использование щипцов, удалить сетчатку глаза от среза хорошо и поместить его на фильтровальную бумагу.
  7. Удаление стекловидного тела и линзы, зажимая области около разорвала зрительного нерва и потянув назад на фильтровальную бумагу. Повторите несколько раз, пока почти все стекловидное удаляется и наглазник выглядит спущена.
  8. Место глаз чашки в чашку Петри с рассечением СМИ, чтобы помыться.
  9. Вырезать глаза чашу в желаемое количество штук (5 штук максимум).
  10. Возьмите одну часть глаза чашку и поместить его под микроскопом.
  11. Зажим склеры и сосудистой оболочки легко собираются на краю сетчатки использованием щипцов. С другой стороны, использование тонкой кистью, чтобы кисть правой между сосудистой оболочки и сетчатки.
  12. Использование коротких, нежных движений, дразнить сетчатки с сосудистой оболочкой, пока не отрывается.
  13. Вырезать 1 дюйм от стерильной пипетки передачи. Используйте это, чтобы подлизываться сетчатки и положите в чашку Петри в среде инкубации мыть.
  14. Используя другой стерильной пипетки передачи с 1 дюйм отрезать, тщательно передачи сетчатки на 0,4 мкм Millicell фильтром (Millipore, Cat No: PICMORG50).
  15. Используйте кисточку, чтобы ориентировать сетчатке стороны ганглиозных клеток вверх.
  16. Свести из сетчатки кистью слегка по краям сетчатки. Свернуть трогательные слой ганглиозных клеток с помощью кисти как можно больше.
  17. Удалите излишки среды на фильтр с передачей пипетки.
  18. Использование щипцов, передачи фильтра на изменение suctioner. Нарисуйте на suctioner 2-3 раза, чтобы удалить все среде инкубации с фильтром.

Торкрет Гена и инкубации сетчатки

  1. Под капотом, место каждого из сетчатки содержащих-фильтров на фильтр стоит в 60 мм в глубину блюда (инкубационный камеры).
  2. Убедитесь, что среда находится в контакте с нижней фильтр и что среда не перекинуться стороны фильтра на сетчатку. Фильтр должен выступать в качестве интерфейса между сетчаткой и среды.
  3. Съемка каждой части сетчатки с двумя пулями. Место генной пушки прямо над ткани, около 3-4 см прочь.
  4. Поместите все камеры инкубации на шейкере в 35 - 37 ° C инкубатора.
  5. Замените среду инкубации с каждым днем. Сетчатки может быть инкубировали в течение не более 6 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. Что я могу сделать с помощью этого метода?

  • Смотрите морфологии клеток ясно.
  • Этикетка клетки для записи на них.
  • Гиперэкспрессией белка, как и PSD95, но и других белков, которые модулируют ответ клетки, например, ионные каналы, рецепторы.
  • Экспресс тормозных РНК.

2. Как долго я могу держать взрослого сетчатки?

  • 4 дня это не проблема для взрослого кролика. После шести дней клетки выглядят "больной", то есть аксоны отказаться, ведь опухоль дендритов и регистрации света ответов становится ненадежным (только ~ 50% клеток оказались свет проблематику после этого времени.
  • Мы продолжали мыши сетчатки в течение 2 дней. Мыши труднее, потому что сетчатка являются васкуляризированной, а также толще, чем кролик сетчатки.

3. Как мне убедиться, что ваш сетчатки здоровых по истечении этого времени?

  • Золотой стандарт записи от них. Ганглия клетки должны по-прежнему реагируют на свет. Вы должны защитить вашу ткань от света во время инкубации, чтобы избежать отбеливания фотопигмент, потому что вы должны анализировать сетчатки от пигментного эпителия для инкубации.
  • Иногда мы также использовали записи микроэлектрода массив для проверки нашей сетчатки.

4. Почему вы хотите управлять только несколько клеток в сетчатке за один раз?

  • Некоторые вопросы не могут быть решены иначе. Рассмотрим, например, ГАМК рецепторы ганглиозных клеток. Вы можете использовать ГАМК-блокаторы, но вы бы подавлять все ГАМКергических передачи в сетчатке, а не только вход в клетку вы заинтересованы Это может быть очень трудно отличить влияние на эту ячейку, в частности, и в целом "сетевой эффект "В целом сетчатке.
  • Если вы хотите увидеть морфологии ясно, что вы не можете маркировать все клетки, в противном случае вы просто получите беспорядок.

5. Является ли этот метод подходит в качестве населения пятно?

  • Количество генов торкрет является случайной процедуры. Вы получите много ганглиозных клеток, многие перемещенные amacrine клеток, некоторые клетки Мюллера, и уж тем более всех других типов клеток.

6. Есть ли какие "уловки" Я должен знать, чтобы заставить ее работать?

  • Не совсем так. Но важно, что вы делаете рассечение сетчатки довольно быстро, так что у вас есть штук на фильтр менее чем за 30 минут. Части не должны быть слишком маленькими, около одного квадратного сантиметра в порядке. Ожидайте 3-4 шт от одного кролика глаз.
  • Храните ваши инструменты вскрытия строго от всего, что входит в контакт с фиксаторов и других агрессивных химикатов.
  • Попробуйте настроить инкубаторе до 35 С, а не 37, так что сетчатке никогда не становится слишком жарко.
  • Вам не нужно добавлять факторов роста, как BDNF к среде, по крайней мере, не делайте это регулярно, но вы должны использовать N2 добавка, 1% лошадиной сыворотки и антибиотики. Мы предоставляем список всех вещей, которые вы и будете нуждаться в качестве дополнительного файла в этой документации.

7. Не могли бы вы гена-пушечный другие вещи, а не плазмиды?

  • Да, мы использовали краситель-сопряженных декстранов или DII и Дио. Но вы могли бы использовать кальций-индикатор красителей, или почти все, что вы можете пальто на золотые или вольфрамовые пули.

8. Каковы ограничения?

  • Прежде всего, времени. Вам придется делать зрительного нерва, а это значит, что ганглиозные клетки в конечном итоге вырождается. Это не проблема на срок до 6 дней, но после этого мы не стал бы доверять сетчатки больше. Теперь, если вы просто хотите, чтобы выразить GFP или какой-либо другой клетке заполнения маркер, инкубации 2-3 дней вполне достаточно, но в некоторых случаях, например, когда вы хотите выразить тормозные РНК, эффект может иметь 4 и более дней шоу. Здесь, вы должны иметь в виду сроки.

9. Какие работы других исследователей следует ли быть в курсе?

  • В сетчатке поле, конечно, лаборатория Рэйчел Вонга в Университете Вашингтона. Там также много работы, люди сделали в других системах, например, гиппокамп подготовки срез. Мы не претендуем, чтобы иметь возможность дать полный обзор литературы, но проверить документы в списке ссылок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
  2. Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
  3. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
  4. Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
  5. Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
  6. Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
  7. Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
  8. Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
  9. Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
  10. Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
  11. Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
  12. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  13. Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
  14. Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
  15. Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
  16. Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
  17. Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
  18. Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
  19. Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
  20. Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
  21. McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
  22. Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  23. Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
  24. Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
  25. Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
  26. O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  27. Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
  28. Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
  29. Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
  30. Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
  31. O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
  32. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
  33. Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
  34. Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
  35. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
  36. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
  37. Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
  38. Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
  39. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
  40. Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
  41. Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
  42. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
  43. Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
  44. Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
  45. Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).

Comments

3 Comments

  1. Is there a difference in cell survival if  you incubate under ilumination as apposed to in a dark incubator?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 18, 2008 - 6:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats