एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए जीन एक्सप्रेशन अध्ययन सरल: आईएल-4 निर्भर जीन एक्सप्रेशन के Namalwa कक्ष में siRNA नॉकडाउन

Biology
 

Summary

यह प्रक्रिया एक त्वरित और आसान कार्यप्रवाह का वर्णन करने के लिए मुश्किल में siRNA शुरू करने के लिए सेल लाइनों transfect और वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति का पालन. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए, बहु - अच्छी तरह से electroporation, थाली, और स्वचालित वैद्युतकणसंचलन स्टेशन महंगा रोबोट से निपटने के लिए की आवश्यकता के बिना जल्दी और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करते हैं.

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McCoy, A. M., Litterst, C., Collins, M. L., Ugozzoli, L. A. Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells. J. Vis. Exp. (38), e1904, doi:10.3791/1904 (2010).

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Abstract

siRNA मध्यस्थता जीन पछाड़ना का उपयोग करने के लिए जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण जारी है. siRNA अध्ययन न केवल downregulating एकल जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आयोजित किया जा रहा हैं, लेकिन यह भी संकेत दे रास्ते और अन्य जटिल बातचीत नेटवर्क पूछताछ. ये मार्ग विश्लेषण प्रासंगिक सेलुलर मॉडल के दोनों का उपयोग करें और विधियों कि सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान के लिए कम गड़बड़ी के कारण की आवश्यकता होती है. Electroporation तेजी के लिए मुश्किल में siRNA और अन्य न्यूक्लिक एसिड शुरू करने के लिए जांच के तहत संकेतन मार्ग बदलने के बिना सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं transfect के लिए एक प्रभावी तरीके के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है. वहाँ के लिए एक सफल siRNA प्रयोग करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, और जबकि कई प्रयोगात्मक चरणों में डेटा की गुणवत्ता में सुधार के लिए काम को आसान बनाने में कर रहे हैं. मदद से आप अपने siRNA मध्यस्थता जीन पछाड़ना परियोजना के साथ आरंभ करने के लिए, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे प्रदर्शन करने के लिए एक मार्ग इकट्ठा करने और कोशिकाओं की गिनती से पहले पोस्ट अभिकर्मक वास्तविक समय पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के माध्यम से electroporation से पूरा अध्ययन. निम्नलिखित अध्ययन आईएल-4 Burkitt लिंफोमा सेल लाइन (Namalwa) में CCL17 निर्भर जीन अभिव्यक्ति में transcriptional STAT6 उत्प्रेरक की भूमिका की जांच. प्रदर्शन तकनीक दोनों पक्षपाती और निलंबन की कोशिकाओं पर एक siRNA आधारित प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होते हैं. हम यह भी बताएंगे कि कैसे TC10 स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनती सेल, एक साथ एकाधिक MXcell electroporation प्रणाली का उपयोग कर नमूने electroporate कैसे, और कैसे करने के लिए एक साथ शाही सेना और Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के साथ गुणवत्ता और मात्रा का आकलन को कारगर बनाने के लिए होगा.

Protocol

1. तैयारी और Namalwa कोशिकाओं की गिनती

  1. संस्कृति कुप्पी से कोशिकाओं निकालें और गोली के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. पीबीएस के एक ज्ञात मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कोशिकाओं निलंबन कोशिकाओं रहे हैं. यदि आप पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं आप के लिए एकत्रित पहले trypsinize की आवश्यकता होगी.
  2. जीवित कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करने के लिए, 0.4% trypan नीले समाधान और pipet मिश्रण की 10 μl के साथ एक गिनती स्लाइड पर 1:01 मिश्रण सेल निलंबन के एक विभाज्य दाग, और तब TC10 स्वचालित सेल में स्लाइड सम्मिलित काउंटर (जैव रेड प्रयोगशालाओं, इंक).
  3. Autofocus के TC10 सेल काउंटर सबसे सटीक गणना को आश्वस्त करने के लिए, और फिर गिनती के साथ आगे बढ़ना. यह स्वचालित रूप से नमूने में रहते हैं और कोशिकाओं कुल कोशिकाओं के घनत्व को निर्धारित करता है.
  4. चुनें viewscreen पर कक्षों को प्रदर्शित करने के लिए छवि को देखने. फिर कमजोर पड़ने कैलकुलेटर का चयन करने के लिए TC10 सेल काउंटर है स्वचालित रूप से सेल मिश्रण की राशि की जरूरत होगी गणना.
  5. यह प्रयोग तीन siRNAs की कुल उपयोग कर रहा है: एक नियंत्रण siRNA और दो अलग अलग STAT6 जीन, अधिक untransfected नियंत्रण लक्ष्यीकरण siRNAs. इस 5 एक्स 10 मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता में 3.6 मिलीलीटर की आवश्यकता है.
  6. वांछित और कमजोर पड़ने कैलकुलेटर में एकाग्रता अंतिम मात्रा मान दर्ज करें, और यह है कि नमूने के लिए जीना सेल गिनती पर आधारित सेल निलंबन की जरूरत की मात्रा की गणना. वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल गणना प्रदर्शन. फिर इन प्रयोगों के लिए एक नया ट्यूब में सेल मिश्रण के लिए आवश्यक मात्रा हस्तांतरण.
  7. गोली कोशिकाओं सेल मिश्रण स्पिन और सभी पीबीएस हटायें. जीन Pulser electroporation बफर (बायो - रेड प्रयोगशालाओं) 3.6 मिलीलीटर में Resuspend. उपयुक्त siRNAs युक्त ट्यूबों में 800 μl aliquots स्थानांतरण और धीरे मिश्रण. कोशिकाओं को अब कर रहे हैं electroporation के लिए तैयार है.

2. 96 अच्छी तरह प्लेट्स में कोशिकाओं Electroporating

  1. Electroporation 96 अच्छी तरह से थाली सभी चार को एक साथ electroporated हो उपचार के लिए प्रतिकृति की अनुमति देता है.
  2. एक 96 अच्छी तरह electroporation थाली के उचित कुओं में सेल निलंबन के 150 μl स्थानांतरण.
  3. MXcell electroporation प्लेट चैम्बर में थाली डालें और ढक्कन बंद करें.
  4. सेल लाइन और बफर इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग Electroporate करें. इन कोशिकाओं को 250 वी के साधन सेटिंग्स के साथ एक घातीय क्षय लहर, 350 μF, और 1000 Ω प्रतिरोध का उपयोग electroporated हैं.
  5. Electroporation के बाद पूरा हो गया है, पिपेट और नीचे धीरे से प्रत्येक कुएं में मिश्रण है और फिर एक टिशू कल्चर पूर्व गर्म मीडिया युक्त थाली कोशिकाओं हस्तांतरण. Namalwa कोशिकाओं RPMI (जीवन टेक्नोलॉजीज) 7.5% FCS और 1% पाइरूवेट के साथ पूरक में उगाए जाते हैं.
  6. नियंत्रण के नमूने है कि electroporated नहीं किया गया है शेष सेल निलंबन से ले रहे हैं और पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से संस्कृति व्यंजन electroporated कोशिकाओं को हूबहू जोड़ा.
  7. 37 में सेते रातोंरात कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2 .
  8. 24 घंटे के बाद, कक्षों की एक सेट में 10 एनजी / मिली अंतिम एकाग्रता रीकॉम्बीनैंट आईएल 4 (आर एंड डी सिस्टम) के साथ प्रेरित किया गया था. नियंत्रण कक्ष के दूसरे सेट केवल अतिरिक्त मीडिया प्राप्त करते हैं. सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक अतिरिक्त 24 घंटे incubated हैं.

3. निकालें और शाही सेना की जांच

  1. विकास की 48 घंटे की कुल के बाद, प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की गिनती, और प्रत्येक अच्छी तरह से शाही सेना निकासी के लिए एक microfuge ट्यूब एक विभाज्य हस्तांतरण, और पश्चिमी सोख्ता या अन्य प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक दूसरे विभाज्य फ्रीज.
  2. गोली कोशिकाओं के नमूने अपकेंद्रित्र, और तब हटाने और प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  3. शाही सेना के निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें. हम आम तौर पर शामिल प्रोटोकॉल के अनुसार ऑरम कुल शाही सेना किट (जैव रेड) का उपयोग करें.
  4. जब siRNA मध्यस्थता जीन पछाड़ना की निगरानी यह विशेष रूप से शाही सेना गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि अपमानित शाही सेना भ्रामक परिणाम दे देंगे. 260/280 अनुपात आरएनए अखंडता संकेत नहीं करता है इसलिए यह महत्वपूर्ण है एक जेल या microfluidic युक्ति पुष्टि करने के लिए शाही सेना को अपमानित नहीं कर रहे हैं पर नमूने को चलाने.
  5. दोनों और एक कदम में गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने के लिए, इन नमूनों Experion स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (जैव रेड) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जाएगा.
  6. पहले, गर्मी नमूने हैं. फिर, प्रधानमंत्री, लोड, और भंवर Experion आरएनए चिप. Experion वैद्युतकणसंचलन स्टेशन में चिप डालें और चलाना शुरू.
  7. रन के बाद पूरा हो गया है, Experion सॉफ्टवेयर स्वतः ही परिणाम है electropherogram, परिणाम तालिका के फार्म (है कि शाही सेना एकाग्रता, ribosomal अनुपात, और शाही सेना गुणवत्ता सूचक संख्या प्रदर्शित करता है), और आभासी जेल में प्रदर्शित (जो एक पारंपरिक शाही सेना के लिए समान दिखता है जेल). उच्च गुणवत्ता कुल शाही सेना के नमूने आमतौर पर 8-10 के एक RQI होगा.

    4. वास्तविक समय पीसीआर

    1. शाही सेना गुणवत्ता की पुष्टि करने के बाद, सीडीएनए प्रतिक्रियाओं के साथ आगे बढ़ना. इस प्रयोग iScript एक कदम RT-पीसीआर मिश्रण (जैव रेड) का इस्तेमाल करने के लिए एक प्रतिक्रिया में सीडीएनए संश्लेषण और वास्तविक समय पीसीआर गठबंधन.
    2. एक मास्टर सभी प्रतिक्रिया प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए शाही सेना टेम्पलेट्स के अलावा अन्य उपकरणों से युक्त मिश्रण है, और उन पीसीआर थाली में वितरित.
    3. एक वर्दी एकाग्रता के लिए शाही सेना गिराए बाद उपयुक्त कुओं आरएनए नमूने जोड़ें. प्रत्येक प्रतिक्रिया तीन प्रतियों में सेट कर दिया जाता है.
    4. थाली सील, और यह CFX384 वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली (जैव रेड) में जगह. उचित प्रोटोकॉल का चयन करें और चलाने शुरू.
    5. एक बार रन पूरा हो गया है, जीन अभिव्यक्ति electroporated के साथ एक नियंत्रण siRNA कोशिकाओं के एक ही सामान्य करने के लिए प्रयोगात्मक siRNA साथ electroporated कोशिकाओं में एक संदर्भ जीन को सामान्यीकृत हित के जीन की अभिव्यक्ति जीन की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है.

    5. SiRNA पछाड़ना का विश्लेषण

    1. CCL17 की अभिव्यक्ति मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर CCL17 के आईएल-4 निर्भर प्रेरण में transcriptional STAT6 उत्प्रेरक की भूमिका की जांच का उपयोग करने के लिए नजर रखी थी. इस प्रयोग के लिए, GAPDH एक संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. वैकल्पिक संदर्भ जीन या एकाधिक संदर्भ जीन में एक ही तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. CFX प्रबंधक सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक ही नमूना संदर्भ जीन की अभिव्यक्ति CCL17 अभिव्यक्ति normalized और स्वचालित रूप से परिणामस्वरूप सामान्यीकृत मूल्यों की तुलना के लिए बस "संदर्भ" और नियंत्रण उपचार (आईएल 4-प्रेरण के बिना नियंत्रण siRNA) के रूप में GAPDH के रूप में चयन करके उपचार को नियंत्रित CFX प्रबंधक सॉफ्टवेयर का प्रयोग सेटिंग्स विंडो में "नियंत्रण".
    3. बिना आईएल-4 प्रेरण, CCL17 प्रतिलेखन कम, विधान के स्तर पर बने रहे नियंत्रण के इलाज के लिए तुलनीय.
    4. आईएल-4 के साथ प्रेरित है और एक सामान्य STAT6 मार्ग (यानी, नियंत्रण siRNA या untransfected नियंत्रण उपचार) बनाए रखने कक्ष CCL17 अभिव्यक्ति के 8-10 गुना प्रेरण दिखाया.
    5. आईएल-4 के साथ, लेकिन STAT6 अभिव्यक्ति या तो STAT6 siRNA की शुरूआत से हिचकते के साथ प्रेरित कक्ष के बारे में केवल 2 गुना अधिक uninduced CCL17 के आईएल-4 प्रेरित अभिव्यक्ति में STAT6 की भूमिका की पुष्टि कोशिकाओं की तुलना में CCL17 अभिव्यक्ति दिखाया.

    6. प्रतिनिधि परिणाम

    चित्रा 1
    चित्रा 1. आईएल 4 संकेतन मार्ग का अवलोकन.
    Dimerization और STAT6 के सक्रियण के लिए एक) अपनी रिसेप्टर के लिए आईएल-4 के बंधन होता है. नाभिक STAT6 translocates सक्रिय और CC17 रूप में लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन सक्रिय.
    बी) आईएल 4-प्रेरण के बिना, CCL17 प्रतिलेखन कम, विधान के स्तर पर रहेगा.
    सी) siRNA की मध्यस्थता STAT6 जीन का मुंह बंद करने के बाद, IL4 के साथ इलाज CCL17 अभिव्यक्ति में कम या कोई वृद्धि करने के लिए नेतृत्व चाहिए.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. CCL17 IL4 द्वारा प्रेरण मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा विभिन्न परिस्थितियों से मापा जाता है.
    ए) के बिना हो आईएल-4 नमूने अभिव्यक्ति की एक कम विधान स्तर जीन अभिव्यक्ति की परवाह किए बिना किया था.
    CCL17 के एक 8-10 गुना प्रेरण के साथ, बी) के रूप में हरे और नीले रंग में दिखाया गया है, नियंत्रण के नमूने आईएल-4 के साथ उपचार के लिए सामान्य प्रतिक्रिया. हालांकि, कोशिकाओं STAT6, लाल और गुलाबी रंग में दिखाया लक्ष्यीकरण siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, आईएल-4 के जवाब में CCL17 अभिव्यक्ति का कम था, विचार का समर्थन है कि STAT6 नाटकों CCL17 के आईएल-4 प्रेरित अभिव्यक्ति में एक भूमिका है.

Discussion

यह लेख कैसे एक मुश्किल में siRNAs electroporate करने के लिए निलंबन सेल लाइन transfect और कैसे इन कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए प्रदर्शन किया है. जब इस प्रक्रिया कर रही यह महत्वपूर्ण है याद करने के लिए सभी नमूनों के रूप में भर में संभव के रूप में लगातार चीजें रखने.

Disclosures

लेखक जैव रेड प्रयोगशालाओं कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन द्वारा नियोजित है.

Comments

1 Comment

  1. What is siRNA control for?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 21, 2010 - 1:04 PM

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