MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS) 1, 2. Ультра-тонкий слой метод включает в себя производство подложки слоем кристаллов матрицы (альфа-циано-4-гидроксикоричных кислота) на образец пластина, которая служит посевом почву для последующей кристаллизации матрицы / аналита смеси. Преимущества ультра-тонкий слой метода по сравнению с другими образец осаждения подходы (например, сухой капли) в том, что он предоставляет (я) большей терпимости к примесей, таких, как соли и моющих средств, (II), более высокое разрешение, и (III), более высоким пространственным единообразия. Этот метод особенно полезен для точного определения массы белков. Протокол был изначально разработан и оптимизирован для анализа мембранных белков и успешно использованы для анализа ионных каналов, метаболит транспортеры, и рецепторы, содержащие от 2 до 12 трансмембранных доменов 2. С первоначальной публикации, он также показал, в равной степени полезны для анализа растворимых белков. Действительно, мы использовали его для большого количества белков, имеющих широкий спектр свойств, в том числе с молекулярной массой выше, чем 380 кДа 3. Текущее время наш метод выбора для молекулярного анализа масса всех белков. Описанная процедура последовательно производит высококачественные спектры, и она чувствительна, надежный и простой в реализации.

Protocol

Это очень важно носить неопудренные перчатки во время подготовки тонким слоем.

Очистка образца пластину

  1. Использование нержавеющей стали или золота MALDI образец пластины.
  2. Промыть метанола и осторожно протрите Kimwipe. Не тереть или скраб поверхность с Kimwipe, чтобы не поцарапать поверхность.
  3. Промыть H 2 O и осторожно протрите Kimwipe.
  4. Промыть метанола и осторожно протрите Kimwipe.
  5. При необходимости повторите MeOH / H 2 O / MeOH цикл очистки, всегда заканчивая MeOH.
  6. Убедитесь в том, что Есть не призрак пятна или остатки, оставшиеся на пластине. Если Есть призрак пятна, промыть пластины с деионизированной водой в то время как трение поверхности с рукой в ​​перчатке (Не трите с Kimwipes). Повторите MeOH / H 2 O / MeOH цикл очистки.
  7. Используйте пластины сразу после мытья.

Подготовка тонким слоем раствора субстрата

  1. Смешайте 1 часть насыщенного 4-ГКЦА (2 части АКС, 1 часть воды, и 0,1% окончательный ТФК) и 3 частей изопропанола.

    Примечание: тонкий слой раствора субстрата очень стабилен, и может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение года. Он также может храниться при 4 ° C.

Создание тонкий слой субстрата

  1. Применение 20-50 мкл раствора субстрата тонким слоем на левом центре пластины, и распространяются со стороной кончика пипетки. Развертки в одном направлении.
  2. Как решение высохнет, органический растворитель быстро испаряется, оставляя за собой мельчайшие капельки воды на поверхности пластины. На данный момент, обернуть указательный палец слой из Kimwipe и сначала осторожно промокните поверхность пластины с ним.
  3. Когда поверхность освобождается от капель воды, протрите все пластины с однонаправленным размашистые движения использованием Kimwipe.

    Примечание: Если решение не распространяется достаточно всей поверхности пластины, повысить АКС состав и воссоздать тонким слоем. Некоторые параметры, которые могут повлиять на распространение решения включают влажности и температуры.

    Примечание: С золотыми пластинами, слой обычно выглядит как желтовато отражение, в зависимости от просмотра и свет углов. С стальных пластин, только края слоя, как правило, видны.

  4. Чистая края пластины с свежим Kimwipe прежде чем поместить его в пластине держателя для предотвращения матрицы от загрязняющих инструмента.

Приготовление раствора матрицы

  1. Насыщенные 4-ГКЦА в FWI (3 части муравьиной кислоты, 1 часть воды, 2 части изопропанол) рекомендуется для анализа как мембранные и растворимые белки. Она также может быть использован в особых случаях для анализа очень больших гидрофобных пептидов (M> 4000 и). Убедитесь, что матрица решений для кровянистые выделения белков не превышает ~ 50% органических веществ, как он будет полностью растворяться тонким слоем субстрата, победив преимущества метода.

Испытания тонкий слой субстрата

  1. Пятно 0.5μL матричного решения на тарелку. Беловатый осадок появится на границе между тонким слоем и капли. Когда этот слой находится на дне капли полностью, обычно в течение 10-15 секунд, аспират избыток жидкости с вакуумной линии. Если она длится более 30 секунд для осадка с образованием, это признак того, что могут быть проблемы с тонкой подложке слой и / или матрица решений.

Пример приложения

  1. Концентрации аналита в исходных растворов должна быть в пределах 10 и 1000 мкм.
  2. Развести анализируемого раствора в матричное решение до конечной концентрации аналита от 0,2 до 2 мкм. Например, начните с 1 мкл образца и 9μl матрицы решение.

    Примечание: Убедитесь, что матрица близка к насыщенной окончательное решение, в противном случае вы будете растворяться тонкой подложке слой.

    Примечание: Аналит концентрации, необходимые для получения достойной сигналов в значительной степени зависит от сложности решения и состав (например, загрязнения) и аналита ionizability.

    Примечание: Если пошаговое разведение не приносит хороших результатов, вы должны попробовать другое разбавления шаг. Хотя нелогичным, высоко концентрированные растворы аналита редко приводят к хорошим спектром.

    Примечание: Мембранные белки как правило, требуют больших разведениях.

  3. Пятно 0.5μl образца / матрицы смесь на тарелку. Беловатый осадок образует на границе между тонким слоем и капли. Этот осадок сокристаллизации матрицы и аналита. Когда этот слой находится на дне капли полностью, УрГУсоюзника в течение 10-15 секунд, аспират избыток жидкости с вакуумной линии. Если она длится более 30 секунд, осадок на форме, это может быть признаком загрязнения настоящее, которое препятствует кристаллизации, или ваш аналита слишком концентрированным.

Calibrant приложений

  1. Подготовка calibrant / матрица смеси таким же образом, с окончательным calibrant концентрации между 0,1-0.5μM.
  2. Пятно 0.5μl calibrant / матрицы смесь на пластину в непосредственной близости от образца пятна. Эта физическая близость используется в псевдо-внутренние процедуры калибровки, в которой пластина перемещается из образцов место для calibrant место во время приобретения образцов, чтобы добавить несколько выстрелов лазерной calibrants к спектру. Этот подход гарантирует более высокую точность калибровки массы, чем внешней калибровки только.

Стиральная шаг

  1. Вымойте каждого пятна с примерно 2μL из ледяной 0,1% водный раствор TFA. Аспирируйте лишнюю жидкость с вакуумной линии.

Приобретение масс-спектрах

  1. Теперь вы готовы к приобретению масс-спектров. Если вы используете решение FWI матрицы, необходимо приобрести вашу спектров как можно скорее, чтобы предотвратить необратимые изменения в аналита, таких как формилирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics