MALDI样品制备:超薄层的方法

Biology

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Summary

这个视频演示的超薄层肽和蛋白质基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI - MS的)分析的矩阵/待测的准备。

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Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

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Abstract

本视频演示了矩阵/分析物的分析肽和蛋白质基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI - MS的)1,2层超薄的准备。超薄层的方法,涉及生产样板,作为一个矩阵/分析物的混合物随后结晶播种地面基材层的基质晶体(α-氰基-4 - 羟基苯甲酸)。比其他样本沉积的方法(如干燥液滴)的超薄层的方法的优点是,它提供了(我)更大的宽容,杂质,如盐和洗涤剂,(二)更好的分辨率,(三)更高的空间统一。精确质量测定的蛋白质,这种方法尤其有用。该协议最初是开发和优化膜蛋白的分析,并成功地用于分析离子通道,代谢产物的运输,和受体,含有2和12个跨膜结构域2之间。由于原来的出版物,它也显示出可溶性蛋白的分析同样有用。事实上,我们已经使用了大量的蛋白质的属性的范围很广,包括那些具有高的分子量为380 kDa的3。这是目前我们所有的蛋白质分子质量分析方法的选择。所描述的过程,坚持生产高品质的光谱,和它是敏感的,功能强大,且易于实现。

Protocol

这是非常重要的,穿在编制了一层薄薄的无粉手套。

清洁样板

  1. 使用不锈钢或黄金的MALDI样品板。
  2. 用甲醇清洗和Kimwipe轻轻擦拭。不要揉搓或刷洗Kimwipe的表面,防止刮伤表面。
  3. 洗净与H 2 O和Kimwipe轻轻擦拭。
  4. 用甲醇清洗和Kimwipe轻轻擦拭。
  5. 如果需要,重复甲醇/ H 2 O /甲醇清洗周期,总是与甲醇结束。
  6. 确保有没有鬼点或盘上的剩余残渣。如果有鬼魂点,与去离子水冲洗,而摩擦表面用戴手套的手(不要擦Kimwipes)板。重复甲醇/ H 2 O /甲醇清洗周期。
  7. 使用后立即清洗板。

一层薄薄的底物溶液的制备

  1. 混合1饱和4 HCCA(乙腈2部分,1份水,0.1%TFA的最终)和3部分异丙醇。

    注:薄层基板的解决方案是非常稳定,可在室温下保存在黑暗的一年。这也可能是保存在4 ° C。

制作薄层基板

  1. 于薄层板左侧的中心,并与一个枪头一侧蔓延的底物溶液20 -50μL。扫一个方向。
  2. 随着解决方案的干燥,有机溶剂的蒸发速度非常快,离开板面背后分钟的水液滴。在这一点上,包裹层的Kimwipe最初轻轻吸干板表面与你的食指。
  3. 当表面上是从水滴中解脱出来,擦拭整个板块使用Kimwipe单向席卷议案。

    注:如果解决方案不扩散到整个板面不够,增加乙腈组成和重新薄层。一些参数可能影响传播的解决方案,包括环境温度和湿度。

    注:与黄金板块,该层通常会出现一种黄色的反思,查看和光线角度而定。用钢板,只有边缘层通常是可见的。

  4. 清洁与新鲜Kimwipe板的边缘,然后放置在盘子持有人,以防止污染仪器矩阵。

基质溶液的制备

  1. 饱和4 HCCA在FWI(甲酸3个部分,1份水,2份异丙醇)膜和可溶性蛋白的分析建议。它也可用于在特殊情况下的分析非常疏水的大肽(M> 4000 U)。确保矩阵的解决方案,用于发现的蛋白质不超过〜50%的有机质含量,因为它会完全溶解的薄层基板,击败了该方法的优势。

薄层基板测试

  1. 盘上的矩阵解现货0.5μL。发白的沉淀物,将出现在薄薄的一层和液滴之间的接口。当这层完全涵盖液滴底部,通常在10-15秒之内,吸出多余的液体真空线。如果需要超过30秒的形式沉淀,这是一个迹象表明,可能有一层薄薄的底物和/或矩阵解的问题。

示例应用程序

  1. 在开始解决方案的分析物的浓度应在10和1000μM。
  2. 在矩阵解到最后一个介于0.2和2μm的分析物的浓度稀释的待测溶液。例如,开始加入​​1μl样品和基质溶液9μl。

    注意:请确保该矩阵是接近饱和的最终解决,否则你将溶解的薄层基板。

    注:获得体面的信号所需的分析物的浓度是高度依赖的解决方案的复杂性和成分(例如,污染物)和分析物的电离度。

    注:如果单步稀释,不会产生良好的效果,你应该尝试另一种稀释步骤。虽然反直观的,高度集中的分析物的解决方案很少产生良好的光谱。

    :膜蛋白通常需要较大的稀释。

  3. 现货样品/基质混合物0.5μL板。发白的沉淀物会形成薄薄的一层和液滴之间的接口。这种沉淀是基质和分析物cocrystallization。当这层完全涵盖液滴底部,乌苏市在10-15秒内的盟友,吸真空线多余的液体。如果需要长于30秒的形式沉淀,它可能是一种迹象的污染物目前,以防止结晶,或您的分析物过于集中。

校准应用程序

  1. 准备以类似的方式,最后的校准浓度在0.1 -0.5μm的之间的校准/基体的混合物。
  2. 现货0.5μL校准/基体的混合物,在接近样本点板。这个物理接近伪内部校准程序,在该板块是从样本点转移到样品采集期间的现场校准,添加几个校准物的激光脉冲的频谱使用。这种方法可以保证较高的质量只比外部校准精度的校准。

洗涤步骤

  1. 大约一个冰冷的0.1%的水溶液TFA的解决方案2μL清洗每一个部位。多余的液体吸真空线。

收购质谱

  1. 您现在已经准备好收购质谱。如果您使用的FWI矩阵的解决方案,您必须获得您的光谱尽快甲酰如待测防止不可逆转的修改。

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References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

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