小鼠胚胎的龙文化,一个系统来评价分枝的分子机制

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Summary

早期胚胎肺器官培养是一个非常有用的的系统研究上皮 - 间质相互作用。上皮和间质的形态发生的具体条件下,可以很容易地在这个系统中操纵收益。

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

原始龙的规格以及分支形态发生和各种肺细胞谱系的形成需要一个与周围的间质细胞和间皮肺胚层的具体互动。肺间质已被证明是肺分支形态发生归纳信号源。上皮 - 间质皮的相互作用也胚胎肺的形态发生的关键。早期胚胎肺器官培养是一个非常有用的的系统研究上皮 - 间质相互作用。可以很容易地在这个系统中操纵(产妇的影响力和血流量的情况下)的特定条件下,上皮和间质的形态发生的收益。更重要的是,这种技术可以很容易地在一个serumless,化学定义的文化传媒。利用表达的蛋白,重组病毒载体和/或分析,反义RNA的转基因小鼠品系,以及RNA干扰基因敲除,可以实现增益和功能丧失。

Protocol

机关文化是一个非常有用的和通用的技术来研究基因和蛋白表达。这些体外培养的方法,可以用来作为初步或补充体内研究。

1。人胚肺隔离

  1. 定时孕鼠的CO 2麻醉处死postcoitum每天11.5或12.5(E11.5 - 12.5)根据美国国立卫生研究院和OLAW指引。动物被放置在一腔,和100%的CO 2介绍。后的动物是无意识的CO 2流量增加。临床死亡的动物必须得到保证。
  2. 以下步骤需要在无菌层流罩条件下完成。子宫是从怀孕的女性。要删除从动物的子宫,怀孕的女性被放置在他们的后面,喷以70%的乙醇。切口在腹部,皮肤是由皮肤向上拉,同时动物的后腿删除。打开腹腔和子宫是从动物中删除。
  3. 血是放置在一个充满冷汉克斯平衡盐溶液(HBSS)50 ml锥形管的子宫冲洗掉,并管轻轻摇晃2分钟。
  4. 子宫立体解剖显微镜下,然后放置在培​​养皿和发布使用弹簧剪刀切开子宫壁的胚胎从子宫。收获的胚胎,使用一个穿孔勺子,并在冰上放置在一个新的Petri菜含有的HBSS。
  5. 立体解剖显微镜下,胚胎肺解剖冷的HBSS(图1)在培养皿菜之一。
  6. 分离出胚胎肺是一个Petri菜含有的HBSS使用无菌移液管放在冰上。

2。人胚肺文化

  1. 500微升至1毫升,每口井的D-MEM/F-12 50个单位/毫升的青霉素,链霉素的补充,增加了一个Nunclon聚苯乙烯盘。
  2. 一个Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜是放在媒体上。当Nuclepore聚碳酸酯履带式蚀刻膜放在媒体上,确保有光泽的一面是对媒体,和粗糙的一面朝上。
  3. Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜使用无菌移液管上放置一个解剖的胚胎肺。
  4. 使用镊子胚胎肺的位置调整。胚胎肺放置在过滤器上应该有一个完整的气管,并放置他们的气管内有一条直线的位置,从而使所有的肺部有相同的内部压力。
  5. Nunclon聚苯乙烯菜是在细胞培养箱(图2)所需的培养时间为转移。

3。材料

1。胚胎全肺隔离

  1. 定时怀孕(C57BL6野生型或转基因)postcoitum每天11.5 13.5(E11.5 - 13.5)牺牲的小鼠。
  2. 汉克斯“平衡盐溶液(HBSS)(1X),液体,无氯化钙,氯化镁,硫酸镁。 (Invitrogen公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州),辅以50个单位/毫升的青霉素,链霉素(Invitrogen公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)。在室温下储存在4 ° C开盘后的HBSS。分装和储存在-20 ° C的青霉素,链霉素
  3. 立体解剖显微镜(莱卡,韦茨拉尔,德国)。
  4. 解剖工具,包括杜蒙钳,细虹膜剪刀(直),诺伊斯弹簧剪刀和莫里亚®汤匙(穿孔)(精细的科学工具,福斯特城,加利福尼亚州)。

2。胚胎全肺文化

  1. 贝科的改良Eagle中等:营养组合的F - 12(D-MEM/F-12)(1X),液体,1:1包含L -谷氨酰胺,但没有HEPES缓冲液。 (Invitrogen公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州),辅以50个单位/毫升的青霉素,链霉素(Invitrogen公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)。保持DMEM/F-12瓶远离光线(如铝箔覆盖)4和存储° C。分装和储存在-20 ° C的青霉素,链霉素
  2. Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜,8.0米,13毫米(的Whatman Nuclepore履带式蚀刻膜(滤纸,弗洛厄姆公园,新泽西州)。
  3. Nunclon聚苯乙烯有盖菜,4口井(罗切斯特,纽约)。
  4. 一次性转让的吸液管,无菌(尔科技,匹兹堡,宾夕法尼亚州)。

图1
图1。 E12的胚胎肺的剖析(一)从右侧查看E12.5全胚胎(B)右前肢已经从胚胎中删除(C)钳的左手拿着手在盘中持稳胚胎举行。箭头指示(四)胚胎肺在于心(删除后的清扫计划)和前向脊柱。此图显示肺部后,皮肤和摘取心脏,(五 )咽清除允许从胚胎中分离完整的肺。(F)的额外咽部组织和食道已被削去。解剖E12.5胚胎肺完整的气管和喉部所示。颅叶(CR),(MED)内侧叶,(CA)尾鳍叶,配件(ACC)叶(LE)的左叶。

图2
图2。FGF9诱导间质细胞和上皮细胞在体外生长的肺扩张的扩张(AC)E12.5肺FGF9的情况下在48小时生长。注意:在分支的增加。增长48小时(DF)的E12.5肺FGF9的存在。请注意,扩张的上皮细胞和间质细胞后24小时的文化(五)早。 48小时后(女),上皮细胞的影响更为明显。比例尺:自动对焦400微米4。

这个实验方法的完整的文本协议,在斯普林格协议。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这项工作是支持的萨班研究所前博士后奖(PMDM),由NIH RO1 HL75773(DW)。

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
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  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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