Mitochondria 높은 결합 랫 마음의 준비

Published 9/23/2010
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Biology
 

Summary

우리는 세포 bioenergetics, biophysical 측정, proteomics 또는 mitochondrial DNA와 lipids 분석의 기능이나 구조 연구 mitochondria 순수, 높은 결합 쥐 심장의 절연을위한 а 프로토콜을 설명합니다.

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Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria. J. Vis. Exp. (43), e2202, doi:10.3791/2202 (2010).

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Abstract

산화 인산화 과정에서 세포 ATP의 생성에 mitochondria의 기능은 널리 인정되고 있습니다. 지난 수십 년 동안 에너지의 생성보다 mitochondria 기타의 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 진보가 있었있다. 이러한 organelles, 포유류의 개발을 신호 및 세포 대사 및 세포 증식 사이의 협력에 자신의 기여뿐만 아니라 노화 역할, apoptosis의 역할을 포함합니다. mitochondria에 의해 변조된 생물 학적 과정에 대한 우리의 이해는 고립과 실험실 동물의 조직에서 손상 mitochondria의 취급에 대한 강력한 방법을 기반으로합니다. 쥐의 심장에서 Mitochondria 노크 아웃 동물 연구를 포함하여 세포 대사의 과거 및 현재 연구에 대한 가장 일반적인 준비의 하나입니다.

여기 커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 신속한 방법을 설명합니다. mitochondria 쥐 심장의 이러한 준비 셀룰러 bioenergetics, mitochondrial DNA, 단백질 및 lipids의 biomolecules, proteomic 연구 및 분석의 교통에 대한 기능 및 구조 연구를위한 훌륭한 개체입니다.

Protocol

소개

쥐의 심장에서 Mitochondria은 세포 대사의 과거 및 현재 연구에 대한 가장 일반적인 준비의 하나입니다. 그들은 야생 입력하거나 노크 아웃 동물에서 다량으로 신속하고 안정적​​으로 얻을 수 있습니다. 일반적인 절차는 트립신, 분류 및 차등 원심 분리에 의해 조직 소화로 구성되어 있습니다.

심장 (그림 1)을 포함한 다양한 조직에서 mitochondria의 분리 동안 보관해야 할 몇 가지 조건이 있습니다.

  • 조직은 직접적으로 얻을 mitochondria의 수율에 영향을 미치는 때문에 철저하게, 다진되어야한다. 심장 조직은 작은 곡선 가위로 말하다하는 것이 가장 좋은 방법입니다 그리고 조직 연삭기는 1.0 주변 mm 직경의 콘센트 구멍의 직경과 마늘을 눌러 사용할 수없는 경우 Latapie 조직 분쇄기를 사용하여 다음 또는 수 있습니다.
  • 그것은 각 단계에서 솔루션의 온도를 유지하기 위해 필요합니다. 따라서 전체 절차는 차가운 방에서 모든 악기에 실시해야하고 솔루션을 준비하고 사전에 냉각해야합니다. 온도 조건이 유지되지 않으면 준비 안정 몇 가지 속성이 손실될 수 있습니다. Mitochondrial 구조 때문에 적극적인 교통 연구 중요 특히, 허용되지 않습니다 (원심 분리하는 동안 예를 들면) 정지 overfreezing 동결 매우 민감합니다.
  • 중요한 매개 변수는 프로 시저의 시간 길이입니다, 격리는 가능한 한 빨리 수행하며 얻은 준비는 즉시 사용할 수있다한다. 따라서, 수술 도구, 솔루션 및 어플 라이언 스는 사전에 준비해야합니다.

재료 및 악기

악기

  1. 스트레이트 운영 가위, 샵 포인트
  2. 곡선 가위
  3. 집게
  4. 페트리 접시
  5. 작은 깔때기 + 나일론 필터의 조각 (prewashed)
  6. 6 비커 ​​50 ML
  7. 두 자성 stirrers 두 얼음 욕조
  8. 큰 얼음 목욕
  9. 이 작은 자석 막대
  10. 힘든 펠렛에 대한 Spatulas
  11. 원심 분리기 튜브
  12. Latapie 조직 보도는 (마늘 프레스로 대체 가능)
  13. 20ml 테플론 - 유리 homogenisers 1 - 2ml
  14. 폐기물 비커
  15. 단백질 결정에 대한 최종 mitochondrial 정지 및 샘플 Eppendorf 튜브
  16. 얼음 욕조

솔루션 (2 쥐 당 계산) :

  1. 워싱 버퍼 : 0.3 M의 자당, 10 MM의 HEPES (산도는 = 7.2), 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1000 ML)
  2. 절연 버퍼 : 0.3 M의 자당, 10 MM의 HEPES (산도 = 7.4), 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MG / ML BSA (시그마 A6003) (세척 버퍼에서 준비 100ml). 알부민 소 혈청은 저렴 지방산 무료 analogues로 대체 수 있습니다. 동일한 버퍼 또는 isotonic 유사 콘텐츠는 버퍼를 Resuspending으로 사용할 수 있습니다.
  3. 트립신 (시그마 T8003) 솔루션 : 1mM HCL에 2.5mg/ml (0.5 ML)
  4. 간장 콩에서 트립신 억제제 (시그마 T9128) 절연 버퍼의 6.5 mg/10 ML

프로토콜

절차의 일반적인 구조는 그림에 표시됩니다. 1. 마음은 냉각과 버퍼, 심실 조직은 excised 귤껍질과 트립신과 photolytic 치료하는 동안 homogenised 세탁에 세탁해야합니다. 정지는 낮은 속도 centrifuged하며 얻은 뜨는은 mitochondria 수집하는 높은 속도로 다시 centrifuged입니다. 계획 실험에 따라 resuspending 버퍼는 다른 isotonic 솔루션으로 대체하실 수 있습니다.

동물은 영국에 따라 종료했다 "동물 (과학 절차) 법." 잘린 다음 경추 전위에 의해. 그것은 바로 동물의 잘린 후 마음을 추출하는 데 필요한, ​​동물 종료 및 심장 추출 사이에 지연이 없다 그래야. mitochondria간에 병렬로 고립이 예상되는 경우 쥐 전에 실험에 밤새 금식을해야합니다.

  1. 버퍼 워싱 40 ML을 포함한 세 비커를 준비합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 3-5 분 얼음 소금 목욕에서 그들을 쿨. 그들을 overfreeze 얼음 결정의 구름이 나타나도록 그냥 시작 후 즉시 사용하지 않도록하십시오.
  2. 참수 암흑의 흉부를 열고 심장을 압축을 풉니다. 작은 incisions를 확인 후 바로 첫 번째 비커에 얼음처럼 차가운 솔루션에 마음을 전송할 수 있습니다. 혈액을 제거하고 두 번째 비커에 넣어 가슴을 묶어라. 각각의 마음에 대해이 작업을 반복합니다.
  3. 필터 종이에 마음을 건조. 모든 지방, 응고된 혈액, auricles 및 fasciae과 수영장 심실 조직을 제거합니다.
  4. 입자의 크기가 1-2mm에 대한 때까지 5 분 주위에 얼음에 페트리 접시에 작은 곡선 가위로 풀링 조직을 말하다.
  5. 조직 보도에 다진 조직을 넣고 통과통과. 자료의 상당한 금액이 때문에 언론의 벽과 바닥의 모든 심장 조직을 수집 언론에 남아있을 수 있습니다 점에 유의하십시오.
  6. 50 ML의 세척 버퍼로 비커에 자료를 전송하고 저어. 그런 다음 나일론 필터를 통해 현탁액을 필터링합니다. 워싱 버퍼와 필터 3 회에 다진 조직을 세척하고 여과물 폐기하십시오.
  7. 워싱 버퍼 20 ML로 씻어 조직을 전송하고 자기 활동가에 얼음 욕조에 넣습니다. 지속적인 교반 하에서 트립신 솔루션의 0.5 ML를 추가하고 타이머를 시작합니다. 또 자기 활동가, 얼음 욕조와 두 번째 50 ML의 비커를 준비합니다.
  8. 4 번째 잠깐 간단히 정지를 해산까지 몇 아래 스트로크와 작은 느슨하게 장착되어 유리 테플론 homogeniser (10 - 15ml)을 사용 부분에 의해 서스펜션 부분을 homogenise. homogenisation 후 두 번째 비커에 정지를 전송합니다. 당신이 총 정지 homogenisation 두 번 수행할 수 있도록, 9 번째 분의 절차를 반복합니다. 부화 15 분 후, 버퍼가 들어있는 트립신 억제제를 분리 10 ML을 추가, 1 분 알을 품다.
  9. 나일론 필터를 통해 다시 정지를 필터링하고 여과물을 저장합니다. 워싱 버퍼의 15-20 ML 1 분 필터와 homogenise ​​왼쪽 미립자 분수를 수집합니다.
  10. 여과액 및 600g에 15 분 원심 분리기로 homogenate를 결합합니다.
  11. 조심스럽게 새로운 원심 튜브에 발생 뜨는을 필터링합니다. 펠렛의 오염을 방지하고 8,500g 15 분 다시 원심 분리기.
  12. 고속 원심 분리 후 뜨는을 버리고 버퍼 폐기 무성한 하얀 바깥쪽 가장자리 층 1 ML과 펠릿 2-3 번 씻어. 주걱으로 펠렛을 휴식하지만 맨 아래에있는 적혈구의 붉은 자리를 피하십시오. 혈액 세포가 루스있다면, homogenisation 전에 정지에서 빨간색 비트를 제거합니다.
  13. 부드러운 pipetting하여 작은 homogeniser하거나 또는와 펠렛을 Resuspend. 더 많은 Isolationbuffer과 정지를 희석하고 8천5백g 15 분 다시 원심 분리기.
  14. 뜨는을 취소, 버퍼 (선택 isotonic 버퍼) Resuspending에서 펠렛을 resuspend 다시 원심 분리기.
  15. 결과 갈색 펠렛은 씻어 그대로 mitochondria가 포함되어 있습니다. 원하는 isotonic 버퍼의 아주 작은 볼륨에서 펠렛을 Resuspend.

그림 1
그림 1. mitochondria 쥐 심장의 분리의 단계 절차에 의해 단계를 보여주는 제도. 상단 부분, 단계 1-9 : 조직 파괴, 트립신 처리 및 homogenisation, 하단 부분, 단계 10-15 : 차등 원심 분리.

Discussion

커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 급속한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 획득 준비는 셀룰러 bioenergetics, proteomic 연구 또는 mitochondrial DNA와 지질 콘텐츠의 분석 기능이나 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이온과 신진 대사 중간체의 적극적인 교통 Biophysical 연구도 수행할 수 있습니다. 그것은 더 submitochondrial 입자, 바깥쪽 막이나 산화 인산화의 정화 별도의 구성 요소를 분리하기 위해 mitochondrial 준비를 처리할 수 있습니다. 설명한 방법은 제이 코 버스와 삭스 1 고립의 표준 프로토콜의 수정입니다. 준비 mitochondria의 예상 수확량은 마음 당 mitochondrial 단백질과 malate / 등 준비 글루 탐 산염은 간의 차이에 대한 호흡 관리 비율의 약 10-15 MG는 0.12 주위 μmol O 2 xmin -1 xmg 단백질의 주 IV의 호흡과 함께 8-12 23 -1 ° 0.25 M의 자당, 10 MM KCl, 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 초기화 상태 III의 호흡 150 μm의의 ADP (정확한 실험 조건 및 추가에 대한 심판을 참조하십시오 5 MM의 칼륨 나트륨 (산도 8.0)를 구성된 매체 C 2.).

특별한주의는 격리 절차의 시작하기 전에 몇 가지 기술적인 세부 정보를 제공해야합니다. 그것은 깨끗한 폴리 카보 네이트 또는 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브를 사용하는 데있어 매우 중요합니다, 따라서 튜브는 철저하게 깨끗한 칫솔과 온수, 그러나 세제 치료를 최소한으로 유지되어야 함께 세탁해야합니다. 또한, 그것은 고립되기 전에 하루 추운 방에 필요한 모든 유리와 악기를 수집하는 것이 좋습니다.

절연 동안 비커에 flasks에서 버퍼를 전송할 때, а 특별한주의가 솔루션에 얼음 물이 방울을 방지하기 위해 제공해야합니다. 조직을 다룰 때 그것은 심장 추출이 동물의 잘린 및 조직을 냉각 사이에도 짧은 시간 지연이 부분 uncoupled mitochondria을 초래 하리라는 사실 때문에 가능 한한 빨리 수행되어야한다는 것을 강조해야합니다. 신속한 냉각 및 제거 마음의 철저한 세척는 헤모글로빈과 적혈구 NADase에서 무료로 표준 준비를 얻기 위해 필수적입니다.

트립신은 homogenisation 중 전단의 강제로 조직의 자화율을 높일 결합 단백질의 저하에 사용됩니다. 그것이 열등 품질의 mitochondria 결과 이​​후 프로 테아제에 대한 조직의 장시간 노출을 피해야한다.

고속 centrifugations 후 원심 분리기 튜브의 벽은 벽에 축적된 지방 소재의 예금을 제거 티슈로 닦아해야합니다.

최종 resuspension의 경우는 저장 (심장 당 버퍼 150-200 μl) 동안 mitochondrial 기능의 손실을 최소화하기 위해 최종 버퍼의 낮은 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 이가의 양이온의 수송 연구에 대한 chelating 요원들이 EGTA 무료 매체를 여러 번 씻어 및 절연 후 첫번째 시간 이내에 사용해야하므로 mitochondria 최종 준비에 존재이어야합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는이 프로 시저에 mitochondrial 생물학 많은 유용한 통찰력과 조언의 분야에 대한 저자의 소개 교수 A. Vinogradov 및 박사 베라 Grivennikova 감사합니다. 저자는 비디오 준비 도움 퀸즈 대학교 미디어 사무실에서 부인 아만다 McKintock에게 감사하고 있습니다.

References

  1. Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
  2. Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).

Comments

6 Comments

  1. Why is it better to fast animals before isolating mitochondria?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2011 - 3:34 PM
  2. For isolation of heart mitochondria fasting is not really essential. However, in order to increase the efficiency of animal use, your colleagues might use other organs such as liver (for mitochondria, microsomes or hepatocytes isolation). If any processing of liver tissue is expected, then fasting is essential to deplete glycogen stores and avoid white precipitate in all stages and excessive washing.

    Reply
    Posted by: Alexander G.
    August 30, 2011 - 7:00 AM
  3. Why do you need trypsin treatment? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2011 - 8:53 AM
  4. Trypsin (or any other protease) is needed to loosen connective tissue and weaken junctions between cardiomyocytes in order to separate them at later stages. It significantly increases the yield of the mitochondria.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 9:01 AM
  5. What were the clearances (gap sizes) you used for the homogenizes? Thanks.

    Reply
    Posted by: Yashar G.
    May 25, 2012 - 3:21 PM
  6. Most of commercially avalable Potter homogeniser have a clearance of 0.1-0.15mm. Ours were closer to 0.15. It should not be completely loose; the plunger should move freely, but you have to feel some resilience.

    Reply
    Posted by: Alexander G.
    May 28, 2012 - 5:31 AM

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