完整的果蝇幼虫体内的亚细胞分辨率成像

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Biology
 

Summary

本协议描述了一种可靠的方法,麻醉和完整的成像

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Zhang, Y., Füger, P., Hannan, S. B., Kern, J. V., Lasky, B., Rasse, T. M. In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution. J. Vis. Exp. (43), e2249, doi:10.3791/2249 (2010).

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Abstract

在光学成像,基因编码的荧光基团和遗传工具最近已经启用了改进,使所需的转基因动物线的建立有效的生物过程的研究,并在生活中甚至在某些情况下的行为,有机体。在这个协议中,我们将描述如何麻醉完整果蝇幼虫,使用挥发性麻醉剂氟烷,跟随在亚细胞决议1-3突触人口的发展和可塑性。虽然其他有用的方法来麻醉果蝇幼虫以前曾描述4,5,6,7,8,本文介绍的协议表明由于以下组合键功能显着改善:(1)麻醉的程度非常高,甚至在被逮捕的心脏跳动允许横向分辨率可达150纳米1,(2)> 90%,每麻醉周期的成活率高,允许在一个小时内的五年多时间点记录天2( 3)高灵敏度,使我们在2个实例研究的动态表达的蛋白质在生理水平。在细节上,我们能够以可视化的突触后的谷氨酸受体亚基GluR - IIA表示,通过在稳定的转基因株系的内源性启动子1和外显子陷阱行FasII - GFP 1。 (4)与其他方法相比4,7幼虫可成像不仅活着,而且还完整无缺(即非解剖)观察到发生在若干天1。影随行的细节功能的各个部分在体内成像室2,3,幼虫,麻醉过程,如何重新确定在幼虫的具体岗位和幼虫安全拆除的正确安装,从成像会议厅。

Protocol

一)大会的成像室

  1. 选择的选择阶段的幼虫(如早期的第三龄幼虫离开约24小时的观测时间间隔在25 °,直到徘徊阶段彗星)。
  2. 幼虫用清水冲洗干净的培养基中,民建联干。
  3. 大衣中心室底部的元素,该地区面临的幼虫,用的卤烃油的薄膜。
  4. 忍受的腹侧方在会议厅内的显微镜物镜面临的幼虫(使神经肌肉接头(NMJ)26日和27日进行成像)(图1 AE)。
  5. 广场上一层油的塑料垫片,电网朝上(图1)通风槽。请确认在这一步:间隔的高度大约有一半的幼虫直径,缝隙宽度应幼虫直径的两倍左右。
  6. 放置在显微镜的成像室

二)幼虫麻醉

  1. 用适当的麻醉设备/蒸发器,连接香港总商会的两个进气口。

    请验证的前端:

    有效地氟醚在房间内的空气浓度不应超过安全法规规定的!只有一个很小的地氟醚的总量是需要麻醉的幼虫。地氟醚1(V / V)15%的应用程序已被证明是一个很好的出发点,确定要在实验中使用的理想浓度。出于安全原因,我们建议,蒸发器,不应该包含更多地氟醚,比需要2-4小时 ,在体内成像。
  2. 浸入一杯水室出口管的另一端,然后打开阀门控制流室约五秒钟的麻醉。

    请确认在这一步:

    气泡在水中升天?如果没有商会是漏水。
  3. 关闭阀门,约三秒钟。
  4. 在显微镜的监视残余幼虫运​​动。检查的心跳和肌肉的运动。如果有必要打开和关闭阀门,在步骤8和9所述,直到完成幼虫麻醉,然后关闭所有阀门,并开始成像。

    请确认在这一步:

    剩余的肌肉运动或心跳表明幼虫是不正确麻醉的。完整的麻醉是至关重要的高分辨率图像。幼虫一般应不长于15-20分钟,麻醉在一个给定的的时间。

三)成像

  1. 确定正确的地位和形象的利益格局(图2-4)。

四)从麻醉恢复

  1. 成像完成后,让空气进入墓室。

    请确认在这一步:

    检查发送的卤素灯幼虫的心跳和肌肉收缩。当肌肉开始收缩,它是安全的删除从成像室的幼虫。
  2. 从麻醉设备分离室,从显微镜中取出。仔细拆解的商会,并放置在泥飞栽培介质的幼虫。
  3. 存放在适当的温度在孵化器的菜。

五)时间序列

  1. 重复步骤2-14,直到已获得足够的时间点。

    替代协议:

    如果30分钟的时间间隔内超过一次成像幼虫,它可能是实际离开它,直到下一次麻醉时间点在成像室。重复步骤7-14,直到已获得足够的时间点。

    请确认在这一步:

    幼虫不保存时间超过两小时的影像室,也不是它是麻醉时间长于15-20分钟。

图1
图1成像室大会 。 (a)将上一层油的幼虫和塑料垫片。 (b)将垫片上一个22 × 22毫米盖玻片和插入室有机玻璃导环,未来(三)修复的金属环的幼虫位置,和(D)关闭室。 (e)现在是随时可以安装在显微镜室。

图2
图2在果蝇幼虫体壁肌肉 。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时成幼虫通过角质层腹侧的肌肉显示。在最浅肌层,27,(AC)显示,在(吉隆坡)最内部的肌肉,第6和7,显示的。比例尺:100微米,片之间的ΔZ是2微米。

图3
图3在果蝇幼虫体壁肌肉的身份。表明身份,是A3,段L3 果蝇幼虫的肌肉。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时通过角质层腹侧到幼虫的肌肉显示。最浅肌层,27岁,在AC显示,在吉隆坡的最内部的肌肉,6日和7所示。比例尺:100微米,ΔZ之间切片是2微米。

图4
图4 果蝇幼虫神经肌肉接头的身份。 (AD)NMJs的一个DGluRIIA MRFP融合蛋白 1表达的可视化。 NMJs是作为观察重点是通过角质层腹侧成幼虫。在(AB),最肤浅的NMJ,27岁,是所示,在CD最内部的NMJs,6日和7所示。比例尺:100微米,ΔZ之间切片为5μm。 (E)和(F)的肤浅的(E)和更大的内部(F)的NMJs的身份,以供参考。

Discussion

最初,该方法的开发研究谷氨酸果蝇幼虫的体壁肌肉的突触。 果蝇神经肌肉接头(NMJ)的特点是一个定型的肌肉和神经细胞的细胞质架构,因而非常适合在体内成像。然而,描述的麻醉协议是不仅限于成像NMJ果蝇幼虫的透明度,有利于适应所描述的协议的研究器官发育,细胞迁移,细胞内的亚细胞的轴突货物和重组运输。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

我们感谢安德烈亚斯Schönle,马克斯 - 普兰克学会国立精神卫生研究所,生物物理化学,德国和大卫J.桑德斯卓姆,美国马里兰州贝塞斯达,国家卫生研究院提供技术咨询。我们感谢弗兰克Kötting,欧洲神经科学研究所,哥廷根构造成像室和麻醉设备。由老年痴呆症Forschung主动TMRYZ赠款支持这项工作是由细胞和分子神经科学,蒂宾根大学的研究生院的奖学金,奖学金由中国国家留学基金管理委员会,SBH的支持。

Materials

Reagents:

  • Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
  • Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
  • Fly culture medium

Equipment:

  • Inverted confocal microscope
  • Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
  • Small paintbrush as used to sort flies
  • Incubator
  • Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
  • Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)

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References

  1. Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
  2. Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. Georg-August-University Göttingen. (1988).
  3. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
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  7. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  8. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).

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