Author Produced

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует протокол neurosphere метод анализа для создания и расширения нервные стволовые клетки из взрослых региона перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Выделение и расширение предполагаемого нервные стволовые клетки (NSCs) от взрослых мышиных мозга была впервые описана Рейнольдса и Вайс в 1992 году использовании определенного химического бессывороточной культуре системы, известной как neurosphere анализа (NSA). В данном анализе большинства дифференцированных типов клеток умирают в течение нескольких дней культуры, но небольшая популяция реагирует фактор роста клеток-предшественников подвергаются активной пролиферации в присутствии эпидермального фактора роста (ЭФР) и / основной фактор роста фибробластов (bFGF). Эти клетки образуют колонии недифференцированных клеток, называемых нейросферы, который, в свою очередь, может быть субкультивировали расширить пул нервные стволовые клетки. Более того, клетки могут вызвать их дифференцировку, создавая трех основных типов клеток центральной нервной системы, т.е. нейроны, астроциты и олигодендроциты. Этот препарат обеспечивает бесценным инструментом для питания последовательными, возобновляемый источник недифференцированных предшественников ЦНС, которые могут быть использованы для экстракорпорального исследований, а также в лечебных целях.

Это видео демонстрирует метод АНБ для создания и расширения NSCs от взрослого регионе перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка мозг от взрослой мыши, микро-рассечение перивентрикулярной области, подготовки ткани и культуры в АНБ. Собрано ткани первой химически переваривается использованием трипсина-EDTA и затем механически диссоциированных в среде НСК для достижения суспензии отдельных клеток и, наконец, помещают в АНБ. Через 7-10 дней в культуре, в результате первичного нейросферы готовы к субкультуре достичь количества клеток, необходимых для будущих экспериментов.

Protocol

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neurosphere анализа 2 получила широкое внимание в научное сообщество не только для выделения и изучения NSCs из ЦНС 4-5, но и для выделения других типов предполагаемых стволовых клеток из различных тканей, таких как рак молочной железы 6 и 7 и сердце для идентификации мозга, молочной железы и толстой кишки опухолью стволовые клетки 8-9 предполагая, что эта культура система может быть применена к ряду соматических и опухолевых предшественников клеточных популяций по всему телу. Некоторые из преимуществ этого метода является его простота, воспроизводимость и генерации неопределенного числа клеток с небольшой кусочек ткани или даже небольшое число клеток в химически определенной среде без сыворотки.

Следует подчеркнуть, что число нейросферы в культуре не представляет количество стволовых клеток в качестве нейросферы могут быть получены либо из добросовестных стволовых клеток или из более ограниченного клеток-предшественников 10. В этой связи анализ был разработан правильно перечислить NSCs в культуре 11.

Различные методы используются, чтобы отделить нейросферы в суспензии отдельных клеток, включая механические и ферментативные методы. Хотя механический метод является оригинальным neurosphere диссоциации метод 2, она требует большого опыта и его эффективность зависит от оператора. Этот метод также может нанести значительный клеточной гибели и повреждения при нанесении неопытного человека, который может уменьшить точность анализов, которые полагаются на neurosphere диссоциации 3. Трипсин-EDTA ферментативной диссоциации также имеет некоторые преимущества и недостатки. Ферментативной диссоциации нейросферы легко, эффективный и воспроизводимый, если оно проводится для соответствующего периода времени, а справа размером нейросферы. Хотя Есть не рядом исследований, сравнивающих эффекты этих двух методов neurosphere диссоциации, наш опыт показывает, что краткие инкубации (3-5 мин) из нейросферы (до 250 мкм) с трипсин-ЭДТА приводит к эффективной диссоциации без нарушения их жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки возможностей. С другой стороны, длинные выдержки из нейросферы (особенно для больших заросших нейросферы) для трипсина-EDTA может привести к серьезному повреждению поверхности клеточных рецепторов, клеточных пищеварения и, возможно, гибели клеток. Длительное воздействие трипсина-EDTA может также вмешиваться в формирование сферы и вызвать клеткам прикрепляться к субстрату и дифференцировать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
  4. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  6. Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  7. Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  8. Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
  9. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. (2008).

Comments

1 Comment

  1. Please email me at azari.hassan@gmail.com if you have any questions regarding this assay.

    Reply
    Posted by: Hassan A.
    May 13, 2011 - 6:59 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics