Author Produced

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة الفحص neurosphere لتوليد وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وكان أول وصف العزلة والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية المفترضة (NSCs) من دماغ الفئران رينولدز الكبار بحلول عام 1992 وايس توظيف المعرفة كيميائيا منظومة الثقافة المصل الحرة المعروفة باسم مقايسة neurosphere (NSA). في هذا الاختبار ، فإن غالبية أنواع الخلايا المتمايزة تموت في غضون بضعة أيام للثقافة ولكن مجموعة صغيرة من الخلايا السليفة عامل النمو استجابة الخضوع الانتشار النشط في وجود عامل نمو البشرة (EGF) و / عامل النمو الأساسي ليفية (bFGF). هذه الخلايا شكل مستعمرات خلايا غير متمايزة تسمى neurospheres ، والذي بدوره يمكن subcultured توسيع مجموعة من الخلايا الجذعية العصبية. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتمييز الخلايا ، توليد ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي أي ، النجمية ، وoligodendrocytes. هذا الاختبار يوفر أداة لا تقدر بثمن لتوريد متناسقة ، مصدر متجدد السلائف CNS غير متمايزة ، والتي يمكن استخدامها في المختبر في الدراسات ، وكذلك لأغراض علاجية.

هذا الفيديو يوضح طريقة لإنشاء وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد الدماغ من الماوس الكبار ، والتشريح الدقيقة في المنطقة المحيطة بالبطين ، وإعداد الأنسجة والثقافة في وكالة الامن القومي. هو أول الأنسجة التي تحصد هضمها كيميائيا باستخدام التربسين - EDTA ثم فصلها آليا في مجلس الأمن القومي لتحقيق المتوسطة تعليق خلية واحدة ومطلي أخيرا في وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام في الثقافة ، مما أدى neurospheres الأولية مستعدون للثقافة فرعية للوصول الى كمية من الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب في المستقبل.

Protocol

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اكتسبت مقايسة neurosphere 2 اهتماما واسعا في الأوساط البحثية ، ليس فقط لعزل ودراسة الجهاز العصبي المركزي من NSCs 4-5 ولكن أيضا لعزل أنواع أخرى من الخلايا الجذعية من الأنسجة المفترضة عديدة ، مثل سرطان الثدي والقلب 6 7 و للتعرف على سرطان الثدي والمخ والخلايا الجذعية السرطانية القولون 8-9 مما يشير إلى أن يمكن تطبيق هذا النظام الثقافة لعدد من السكان الجسدية وورم الخلايا السليفة في جميع أنحاء الجسم. بعض من مزايا هذه الطريقة تشمل في البساطة ، واستنساخ جيل من عدد غير محدد من الخلايا من قطعة صغيرة من الأنسجة أو حتى عدد قليل من الخلايا في وسيلة تعريف كيميائيا مجانا المصل.

وينبغي التأكيد على أن عدد neurospheres في الثقافة لا يمثل عدد الخلايا الجذعية ويمكن أن تستمد من neurospheres إما بحسن نية أو الخلايا الجذعية من أكثر الخلايا الاصلية يقتصر 10. في هذا الصدد تم وضع مقايسة تعداد صحيح NSCs في الثقافة 11.

وتستخدم أساليب مختلفة لفصل neurospheres في تعليق خلية واحدة بما في ذلك الطرق الميكانيكية والأنزيمية. على الرغم من الطريقة الميكانيكية هي الطريقة الأصلية تفارق neurosphere 2 ، فإنه يتطلب الكثير من الخبرة والكفاءة فيها تختلف تبعا للمشغل. هذا الأسلوب قد يسبب موت الخلايا كبيرة أيضا والأضرار إذا ما طبقت من قبل فرد عديم الخبرة ، والتي يمكن أن تقلل من دقة المقايسات التي تعتمد على تفكك neurosphere 3. التربسين - EDTA تفارق الأنزيمية أيضا بعض مزايا وعيوب. تفارق الأنزيمية من neurospheres غير سهلة وفعالة وقابلة للتكرار إذا أجريت لمدة زمنية مناسبة وعلى neurospheres في الحجم الصحيح. على الرغم من أنه لا توجد جنبا إلى جنب الدراسات المقارنة بين آثار هذه الأساليب اثنين من التفكك neurosphere ، فإن تجربتنا تبين أن حضانة قصيرة (3-5 دقائق) من neurospheres (تصل إلى 250 ميكرون) مع التربسين - EDTA النتائج في كفاءة تفارق من دون إزعاج لهم البقاء والانتشار وتمايز القدرات. من ناحية أخرى ، قد طويلة من التعرض neurospheres (وخاصة بالنسبة للneurospheres متضخمة كبير) لالتربسين - EDTA تسبب ضررا خطيرا للمستقبلات سطح الخلية ، والهضم الخلية وموت الخلايا المحتملة. قد التعرض المفرط لالتربسين - EDTA تتداخل أيضا مع تشكيل الخلايا ويسبب المجال لإرفاق الركيزة وتمييزه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
  4. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  6. Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  7. Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  8. Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
  9. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. (2008).

Comments

1 Comment

  1. Please email me at azari.hassan@gmail.com if you have any questions regarding this assay.

    Reply
    Posted by: Hassan A.
    May 13, 2011 - 6:59 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics