العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere
Summary
هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة الفحص neurosphere لتوليد وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه.
Abstract
وكان أول وصف العزلة والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية المفترضة (NSCs) من دماغ الفئران رينولدز الكبار بحلول عام 1992 وايس توظيف المعرفة كيميائيا منظومة الثقافة المصل الحرة المعروفة باسم مقايسة neurosphere (NSA). في هذا الاختبار ، فإن غالبية أنواع الخلايا المتمايزة تموت في غضون بضعة أيام للثقافة ولكن مجموعة صغيرة من الخلايا السليفة عامل النمو استجابة الخضوع الانتشار النشط في وجود عامل نمو البشرة (EGF) و / عامل النمو الأساسي ليفية (bFGF). هذه الخلايا شكل مستعمرات خلايا غير متمايزة تسمى neurospheres ، والذي بدوره يمكن subcultured توسيع مجموعة من الخلايا الجذعية العصبية. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتمييز الخلايا ، توليد ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي أي ، النجمية ، وoligodendrocytes. هذا الاختبار يوفر أداة لا تقدر بثمن لتوريد متناسقة ، مصدر متجدد السلائف CNS غير متمايزة ، والتي يمكن استخدامها في المختبر في الدراسات ، وكذلك لأغراض علاجية.
هذا الفيديو يوضح طريقة لإنشاء وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد الدماغ من الماوس الكبار ، والتشريح الدقيقة في المنطقة المحيطة بالبطين ، وإعداد الأنسجة والثقافة في وكالة الامن القومي. هو أول الأنسجة التي تحصد هضمها كيميائيا باستخدام التربسين – EDTA ثم فصلها آليا في مجلس الأمن القومي لتحقيق المتوسطة تعليق خلية واحدة ومطلي أخيرا في وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام في الثقافة ، مما أدى neurospheres الأولية مستعدون للثقافة فرعية للوصول الى كمية من الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب في المستقبل.
Protocol
Discussion
اكتسبت مقايسة neurosphere 2 اهتماما واسعا في الأوساط البحثية ، ليس فقط لعزل ودراسة الجهاز العصبي المركزي من NSCs 4-5 ولكن أيضا لعزل أنواع أخرى من الخلايا الجذعية من الأنسجة المفترضة عديدة ، مثل سرطان الثدي والقلب 6 7 و للتعرف على سرطان الثدي والمخ والخلايا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
