载入果蝇与神经末梢钙指标

Biology

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Summary

钙是一种在神经系统中无处不在的使者,触发神经递质释放和突触强度的变化。在这里,我们展示了一个加载的Ca 2 +指标到果蝇的神经终端的技术。我们也证明所需设备的制造,并强调技术的成功的关键点。

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Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

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Abstract

钙在神经系统中的许多角色,但没有更令人印象深刻,作为神经递质释放的触发,并没有比支持学习和记忆的突触可塑性的重要使者深刻。为了进一步阐明的分子基础的Ca 2 +依赖的突触机制,需要一个模型系统,基因可塑性和生理访问。果蝇提供了这样一个模型。在这个系统中,基因编码的荧光指标,可用来检测神经末梢的Ca 2 +的变化。然而,这些指标是有限的敏感性钙+和常常表现出非线性响应。合成荧光指标更适合于测量迅速的Ca 2 +与神经活动有关的变化。在这里,我们展示了一个加载到果蝇幼虫生活的神经末梢葡聚糖偶联合成的Ca 2 +指标的技术。特别强调的是放置在协议的那些方面最关键该技术的成功,例如如何以避免沿的隔离神经静电,保持编制的健康在扩展装载期间,,并确保轴突生存提供的Ca 2 +促进密封切断轴突末梢。低亲和力右旋糖酐标记的Ca 2 +的指标,如氟- 4和rhod,这显示了一个高信号的信噪比,同时微创干扰突触前的Ca 2 +动力学。葡聚糖共轭有助于防止进入细胞器如线粒体扣押+指标。加载技术可以同样适用于幼虫,胚胎和成人。

Protocol

  1. 选择一个干净的清扫菜,没有接触过任何固定液。

  2. 解剖流浪3 龄果蝇在施耐德的果蝇含有的中等幼虫+和L -谷氨酰胺,(不削减任何神经或损伤肌纤维第7,6,13或12) 。

  3. 选择一个12微米的小费(内径)的玻璃灌装吸管。

  4. 使用注射器和油管(应用负压吸管)确保不妨碍枪头。

  5. 选择一个优良的塑料填充丝可插入玻璃吸管的长度。

  6. +指标绘制到5毫米右旋糖酐标记的 2〜1厘米的塑料丝。

  7. 切段所有的神经。

  8. 支持吸管上一个坡道,让枪头方法解剖幼虫的腹侧中线。

  9. 画出一个神经段第四砍完,不捏的神经,进入移液器(包括施耐德的培养基中的少量)。

  10. 取出油管,插入吸管的塑料丝,直到结束的灯丝在50微米的神经切断(避免触及神经)。

  11. 弹出足够的Ca 2 +到结束施耐德的中期量增加约33%(终浓度应小于2MM)神经指标。重要的 - 这必须在5分钟切割神经内完成。

  12. 在室温下放置在黑暗的准备,而神经负载。

  13. 40分钟后取出的Ca 2 +使用灯丝的指标。

  14. 离开地方吸管和填写完全新鲜施耐德的中期的,因为这将被用于刺激的神经脉冲。

  15. 允许的Ca 2 +指标在神经平衡至少60分钟,但不超过4小时,才开始的Ca 2 +成像。

  16. 冲洗新鲜施耐德的中期每30分钟一班,而它是平衡的准备。

  17. 20分钟前成像取代施耐德与淋巴,像第六溶液(HL6; MacLeod等人2002年,2003年)的中期。

  18. L -谷氨酸或谷氨酸可以添加到HL6在7MM的解决方案,脱敏突触后的谷氨酸受体,以防止神经诱发的肌肉收缩(MacLeod等人2004年。赖夫等人2002年,2005年)。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

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References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

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