Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Biology

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Summary

O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca 2 +-indicadores em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.

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Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

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Abstract

Cálcio desempenha muitas funções no sistema nervoso, mas nenhum mais impressionante do que como o gatilho para a liberação do neurotransmissor, e ninguém mais profundo do que como o mensageiro essencial para a plasticidade sináptica que apoie a aprendizagem e memória. Para melhor elucidar as bases moleculares de Ca 2 + dependentes de mecanismos sinápticos, um sistema modelo é necessário que seja geneticamente maleável e fisiologicamente acessível. Drosophila melanogaster fornece um modelo desse tipo. Neste sistema, geneticamente codificados indicadores fluorescentes estão disponíveis para detectar Ca 2 + mudanças nas terminações nervosas. No entanto, estes indicadores têm limitada sensibilidade ao Ca 2 + e muitas vezes mostram uma resposta não linear. Sintética indicadores fluorescentes são mais adequadas para medir a rápida Ca 2 + mudanças associadas com a atividade do nervo. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar dextran-conjugados sintéticos Ca 2 + indicadores em terminais nervosos viver em larvas de Drosophila. Ênfase particular é colocada sobre os aspectos do protocolo mais críticos para o sucesso da técnica, como forma de evitar descargas de eletricidade estática ao longo dos nervos isolados, manter a saúde da preparação durante os períodos de carga estendida, e garantindo a sobrevivência do axônio, fornecendo Ca 2 + para promover a vedação de terminações dos axônios cortados. Baixa afinidade dextran-conjugados Ca 2 +-indicadores, como a fluo-4 e Rhod, estão disponíveis, que mostram uma relação sinal-ruído alta, enquanto minimamente perturbar Ca 2 + pré-sináptica dinâmica. Dextran conjugação-ajuda a prevenir Ca 2 + indicadores sendo seqüestrado em organelas como as mitocôndrias. A técnica de carregamento pode ser aplicado igualmente para as larvas, os embriões e adultos.

Protocol

  1. Selecione um prato de dissecação limpa que não tenha sido exposto a qualquer fixadores.

  2. Dissecar um errante 3 º instar larva Drosophila em Meio Schneider Drosophila contendo Ca 2 + e L-glutamina, (não cortar qualquer nervos ou fibras musculares danos n º s 7, 6, 13 ou 12).

  3. Selecione um copo de enchimento da pipeta com uma ponta de 12 mícrons (diâmetro interno).

  4. Usando uma seringa e tubos (para aplicar pressão negativa para a pipeta) garantir que a ponta da pipeta não está obstruído.

  5. Selecione um plástico fino filamento de enchimento que podem ser inseridos ao longo do comprimento da pipeta de vidro.

  6. Desenhe ~ 1 cm de 5 mM dextran-conjugados Ca 2 +-indicador para o filamento de plástico.

  7. Cortar todos os nervos segmento.

  8. Apoio a pipeta em uma rampa que irá permitir a ponta da pipeta a abordagem da linha média ventral da larva dissecados.

  9. Desenhe o corte final de um nervo para o segmento No.4, sem comprimindo o nervo, na extremidade da pipeta (incluir uma pequena quantidade de meio Schneider).

  10. Remova o tubo e insira o filamento de plástico para a pipeta até o final do filamento é dentro de 50 microns do fim do corte do nervo (evitar tocar o nervo).

  11. Eject suficiente Ca 2 +-indicador para a terminação nervosa para aumentar o volume de meio a Schneider em cerca de 33% (concentração final deve ser <2mm). Importante - Este deve ser concluída dentro de 5 minutos de cortar o nervo.

  12. Coloque a preparação no escuro à temperatura ambiente, enquanto as cargas do nervo.

  13. Após 40 minutos retire o Ca 2 + indicador usando o filamento.

  14. Deixe a pipeta no lugar e preenchê-lo completamente com o meio Schneider fresca, como isto será usado para aplicar pulsos estimulantes para o nervo.

  15. Permitir que o Ca 2 + indicador de equilibrar no nervo por pelo menos 60 minutos, mas não mais do que 4 horas, antes de iniciar Ca 2 +-imagem.

  16. Lavar a preparação com meio fresco Schneider cada 30 minutos enquanto ele é equilibrante.

  17. 20 minutos antes de substituir o meio de imagens Schneider com hemolinfa-Like solução No.6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).

  18. L-ácido glutâmico ou glutamato podem ser adicionados a HL6 solução a 7mm para dessensibilizar os receptores pós-sinápticos do glutamato para evitar nervo evocadas contração muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

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References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

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