Summary
O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca 2 +-indicadores em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.
Abstract
Cálcio desempenha muitas funções no sistema nervoso, mas nenhum mais impressionante do que como o gatilho para a liberação do neurotransmissor, e ninguém mais profundo do que como o mensageiro essencial para a plasticidade sináptica que apoie a aprendizagem e memória. Para melhor elucidar as bases moleculares de Ca 2 + dependentes de mecanismos sinápticos, um sistema modelo é necessário que seja geneticamente maleável e fisiologicamente acessível. Drosophila melanogaster fornece um modelo desse tipo. Neste sistema, geneticamente codificados indicadores fluorescentes estão disponíveis para detectar Ca 2 + mudanças nas terminações nervosas. No entanto, estes indicadores têm limitada sensibilidade ao Ca 2 + e muitas vezes mostram uma resposta não linear. Sintética indicadores fluorescentes são mais adequadas para medir a rápida Ca 2 + mudanças associadas com a atividade do nervo. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar dextran-conjugados sintéticos Ca 2 + indicadores em terminais nervosos viver em larvas de Drosophila. Ênfase particular é colocada sobre os aspectos do protocolo mais críticos para o sucesso da técnica, como forma de evitar descargas de eletricidade estática ao longo dos nervos isolados, manter a saúde da preparação durante os períodos de carga estendida, e garantindo a sobrevivência do axônio, fornecendo Ca 2 + para promover a vedação de terminações dos axônios cortados. Baixa afinidade dextran-conjugados Ca 2 +-indicadores, como a fluo-4 e Rhod, estão disponíveis, que mostram uma relação sinal-ruído alta, enquanto minimamente perturbar Ca 2 + pré-sináptica dinâmica. Dextran conjugação-ajuda a prevenir Ca 2 + indicadores sendo seqüestrado em organelas como as mitocôndrias. A técnica de carregamento pode ser aplicado igualmente para as larvas, os embriões e adultos.
Protocol
- Selecione um prato de dissecação limpa que não tenha sido exposto a qualquer fixadores.
- Dissecar um errante 3 º instar larva Drosophila em Meio Schneider Drosophila contendo Ca 2 + e L-glutamina, (não cortar qualquer nervos ou fibras musculares danos n º s 7, 6, 13 ou 12).
- Selecione um copo de enchimento da pipeta com uma ponta de 12 mícrons (diâmetro interno).
- Usando uma seringa e tubos (para aplicar pressão negativa para a pipeta) garantir que a ponta da pipeta não está obstruído.
- Selecione um plástico fino filamento de enchimento que podem ser inseridos ao longo do comprimento da pipeta de vidro.
- Desenhe ~ 1 cm de 5 mM dextran-conjugados Ca 2 +-indicador para o filamento de plástico.
- Cortar todos os nervos segmento.
- Apoio a pipeta em uma rampa que irá permitir a ponta da pipeta a abordagem da linha média ventral da larva dissecados.
- Desenhe o corte final de um nervo para o segmento No.4, sem comprimindo o nervo, na extremidade da pipeta (incluir uma pequena quantidade de meio Schneider).
- Remova o tubo e insira o filamento de plástico para a pipeta até o final do filamento é dentro de 50 microns do fim do corte do nervo (evitar tocar o nervo).
- Eject suficiente Ca 2 +-indicador para a terminação nervosa para aumentar o volume de meio a Schneider em cerca de 33% (concentração final deve ser <2mm). Importante - Este deve ser concluída dentro de 5 minutos de cortar o nervo.
- Coloque a preparação no escuro à temperatura ambiente, enquanto as cargas do nervo.
- Após 40 minutos retire o Ca 2 + indicador usando o filamento.
- Deixe a pipeta no lugar e preenchê-lo completamente com o meio Schneider fresca, como isto será usado para aplicar pulsos estimulantes para o nervo.
- Permitir que o Ca 2 + indicador de equilibrar no nervo por pelo menos 60 minutos, mas não mais do que 4 horas, antes de iniciar Ca 2 +-imagem.
- Lavar a preparação com meio fresco Schneider cada 30 minutos enquanto ele é equilibrante.
- 20 minutos antes de substituir o meio de imagens Schneider com hemolinfa-Like solução No.6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
- L-ácido glutâmico ou glutamato podem ser adicionados a HL6 solução a 7mm para dessensibilizar os receptores pós-sinápticos do glutamato para evitar nervo evocadas contração muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).