V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序

Immunology and Infection
 

Summary

可以推断出艾滋病毒嗜性病毒包膜V3区。 V3是一式三份,采用巢式RT - PCR扩增,测序,PCR扩增,并解释使用生物信息学软件。被列为非R5病毒与G2P分数低1个或多个序列(S)的样品。

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McGovern, R. A., Harrigan, P. R., Swenson, L. C. Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3. J. Vis. Exp. (46), e2531, doi:10.3791/2531 (2010).

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Abstract

背景:收到CCR5拮抗剂类艾滋病毒治疗的一个药物之前,患者必须接受艾滋病毒嗜性测试,以确认他或她的病毒的人口使用蜂窝进入了CCR5辅助受体,而不是替代辅助受体。向性测试的方法之一,是研究HIV包膜,与辅助受体相互作用的V3区序列。

方法:从血浆中提取病毒RNA。 V3区是一式三份嵌套逆转录PCR扩增。的扩增,测序和分析软件,RE_Call。如geno2pheno生物​​信息学算法推断病毒嗜从V3区序列,然后提交。推断序列被非R5,如果他们geno2pheno的假阳性率低于5.75%。如果从样品中的三个序列中的任何一个推断非R5,病人是不会回应一个CCR5拮抗剂。

Protocol

程序:

1。提取:

此基因型的艾滋病毒嗜测试样本输入所需的至少500μL血浆。

  1. easyMAG(生物梅里埃)自动提取,或提取您的实验室的首选方法500μL血浆中提取的HIV RNA。
    成60微升等分洗脱提取的病毒RNA。贮存在-20摄氏度或反向转录- PCR解压后立即开始。

2。 RT - PCR检测:

样品提取液4μL将被放大,用巢式RT - PCR方法一式三份。必须建立的RT - PCR反应在PCR洁净室。

  1. 计算被放大的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
    试剂 量(μl)
    (1X反应)
    DEPC处理水 10.56
    2倍的反应缓冲液 20
    50%的蔗糖和0.04%溴酚蓝混合 4
    针对艾滋病毒V3区的上游引物 0.32
    反向引物 0.32
    酶 - 标​​第三步白金Taq DNA聚合酶RT - PCR系统 0.8
    共有 36
    表1 1单步RT - PCR反应所需的试剂卷。
    每一个步骤RT - PCR反应需要以下几招:
    • 10.56μL,DEPC处理水
    • 20μL的反应缓冲液2倍
    • 4μL,50%的蔗糖和0.04%溴酚蓝混合
    • 0.32μL的远期目标艾滋病毒V3区引物
    • 0.32μL的反向引物
    • 0.8μL的酶
    对于一个总的36μL每反应。
  2. 打成线了旁边一个空行中的样品提取液管,96孔PCR板。
  3. 使用一个中继器移液器,加36μL样本混合,以每孔PCR板,有3口井是每个样本提取物准备。
    *注意:此过程必须一式三份,以最低的,以确保有足够的采样病毒的人口。
  4. 使用8通道多道移液器,将其3井的样品提取液4μL。更改彼此之间另外的提示。
  5. 用PCR地带帽盖井。
  6. 当转移是comlete,放置在一个热循环PCR板。设置热循环与下面的程序运行:30分钟52℃2分钟94 ° C,40个周期(15秒94℃,在5530秒° C和1.5分钟在68℃)5分钟68 ° C
  7. 删除从热循环PCR板。板可以在室温下保存。

继续进行第二轮PCR步骤

3。第二轮PCR:

  1. 计算被放大的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
    试剂 量(μl)
    (1X反应)
    DEPC处理水 13.45
    60%的蔗糖,0.08%甲酚红混合 2
    罗氏公司的HiFi系统缓冲区2 2
    MgCl 2的 0.8
    的dNTP 0.16
    正向PCR引物 0.15
    反向PCR引物 0.15
    展开高保真酶 0.29
    共有 19
    表2:1 第二轮PCR反应所需试剂卷。
    每个第二轮PCR反应需要以下几招:
    • 13.45μL,DEPC处理水
    • 2μL60%蔗糖,0.08%甲酚红混合
    • 2μL罗氏高保真系统缓冲区2
    • 0.8μLMgCl 2的 25毫米
    • 0.16μL,25毫米的dNTP
    • 0.15μL,两者的正向和反向PCR引物
    • 0.29微升展开高保真酶
    总额的19%μL反应。
  2. 在后放大室,采用8通道多道移液器,转移到第二轮PCR缓冲液1μLRT - PCR的模板。更改彼此之间另外的提示。
  3. PCR地带帽盖井和第二轮PCR板转移到热循环。
  4. 设置热循环与下面的程序运行:2分钟94 ° C 35个周期(15秒94℃,30秒,在55℃,1分钟72 ° C)7分钟,在72 ° C
  5. 删除板从热循环后的温度已恢复到25 ° C。

4。凝胶电泳:

为了确认,V3区已成功地扩增,凝胶电泳的步骤执行。

  1. 准备琼脂糖凝胶琼脂糖粉0.8克,50毫升的1X TAE缓冲。搅拌融化〜1分钟或微波,直到琼脂糖完全溶解。
  2. 加入6μL安全的SYBR凝胶染色和漩涡混合。
  3. 倒入凝胶托盘的解决方案,并补充足够的凝胶梳子,以适应PCR检测井的数量。
  4. 一旦凝胶干燥,取出梳子和地方凝胶,凝胶仪器,以确保它是完全淹没在1X TAE缓冲。
  5. 使用10μL多道移液器,加其在自己的凝胶以及每个PCR样品8μL。盖PCR板,扩增后的凝胶已被添加到。
  6. 加入6μL的DNA阶梯,每行至少有一个。
  7. 运行〜100V〜10分钟的凝胶仪器,确保,带不跑凝胶。
  8. 到紫外线的反式照明灯凝胶和凝胶的图片。
    PCR扩增的DNA井会出现亮,说明一个成功的放大。
  9. 请注意:所有样品的三个扩增成功。如有必要,重复这些样本少于3扩增RT - PCR检测。

进行测序

5。测序:

病毒基因扩增后,样品可以准备进行测序。测序反应,应在一个放大后室地方。

  1. 从冰箱和测序引物,从冰箱中取出BigDye。让BigDye在室温下解冻,不超过1小时。
  2. 计算运行的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
    试剂 量(μl)
    (1X反应)
    BigDye 0.3
    BigDye缓冲区 2.1
    底漆 2.6
    共有 5.0
    表3。试剂卷1测序反应。
    *注:准备为每个​​引物单独组合。
    **注:BigDye缓冲区用于测序反应,可作如下准备:混合17.5毫升Trizma盐酸缓冲溶液(pH9.0)(1米)和氯化镁0.125毫升(1米)。把100毫升的试剂级水终体积。这应该是存储在2-8 ° C。
  3. 从3.3中使用的计算,准备为每个​​引物和不超过5秒的旋涡混合的测序反应。分装成悬液0.2ml地带管。
  4. 分装5μL测序反应混合到适当的板采用多道移液器井。罩板(S),其中包含一个Kimwipe测序反应混合,待用。
  5. 准备加入180μL无菌水巴克斯特,其余的PCR产物的扩增PCR产物1:15稀释。
  6. 加入1μL稀释后的样品,以适当的板井底部,改变枪头。
  7. 当完成转移样品,密封带帽子和涡板1秒
  8. 放置在离心机板。 145克,当旋转速度达到145克设置速度,停止旋转。
  9. 板放置在下面的程序设置为一个热循环仪(S):25个循环(10秒@ 96 ° C,5秒,50℃,55秒@ 60 ° C。)量应至少6μL 。这个周期应该采取大约1.2小时。

继续降水

6。降水:

“清理”病毒的基因测序反应,进行乙醇沉淀,用95%乙醇。

  1. 从热循环检索板块,并带来一个后放大器fication房间。
  2. 删除地带的上限和地点,以便他们在一个干净的纸巾或Kimwipe。
  3. 移液器4μL工作EDTA的醋酸钠溶液每个样品的一面。塔盘轻轻EDTA钠溶液下降到井底。可以使用同样的技巧,只要不接触样品在井底。
    *注:工作EDTA的醋酸钠溶液可作如下准备:
    1. 准备246.1克醋酸钠溶解于1 L试剂级水3M醋酸钠。 0.45微过滤器的过滤解决方案,并准备50毫升分装。
    2. 准备库存EDTA -乙酸钠溶液(1.5米NaOAc,250毫米EDTA)混合等量的醋酸钠(3米)和EDTA溶液(500毫米),pH值8.0。
    3. 准备工作EDTA - 醋酸钠溶液混合EDTA - 醋酸钠溶液与试剂级水(10毫升+ 30毫升)三部分组成的一个部分股票。
  4. 移取40μL到对面的样品井,并冷冻95%的乙醇取代地带帽。
  5. 密封帽和旋涡10秒板。点触板,驱逐任何气泡。
  6. 放置至少30分钟,最多2小时冷冻在-20 ° C的板块。
    1. 一旦发生降水,从冰箱和一个20分钟3700转离心中删除的板块。
    2. 从冰箱中取出适量的高迪甲酰胺(美国应用生物系统公司),使其能够解冻之前变性。
    *注:一个完​​整​​的96孔板变性要求960μL希迪甲酰胺,因此它有利于事先准备〜1.1mL等分。
  7. 在纺织板块中,删除和丢弃的条形帽。反转盘在废物容器(如垃圾箱),倒出上清液。任何剩余的上清摆脱印迹纸巾倒板。
  8. 折板面2张纸巾和地点。在离心机和旋转板面朝下放置在145克,停止旋转,当它到达145克。
  9. 从离心机中取出的钢板和检查,以确保井空。移液器155μL冷冻入井95%的乙醇。
  10. 丢弃到废物的容器和纸巾的污点上清,重复离心4.10。
  11. 从离心机中取出盘子后,丢弃用过的纸巾,让板的立场面对2-5分钟,以允许任何剩余的乙醇蒸发。

继续以变性

7。变性

  1. 检索到一个容器足够大的多道移液器解冻希迪甲酰胺和倒出,
    *注:如果使用预分装的措施为6.7b指出,一管是要运行的每个96孔板需要。
  2. 使用多道移液器,分发到所有的孔10μL希迪甲酰胺盘上,包括那些都是空的。
  3. 与隔垫覆盖板,形成一个密封。
  4. 2分钟,放置于90 ° C的板在热循环。
  5. 变性后,放置在一个盘子持有的板块,然后加载到音序器。上传一个准备测序布局。板可保持在-20 ° C,最多一个星期前执行的测序运行。

8。使用基本电话软件产生的数据分析。

  1. 使用召回执行调用,无需人工干预的自动基地,单引物覆盖是可以接受的的。召回是一个自定义的基本电话软件,可以在以下网址找到:http://pssm.cfenet.ubc.ca/
    *注:需要登录的帐户。要建立一个帐户,点击“注册”按钮,在登录页面。一旦帐户已经创建,您可以访问上传页面。
  2. 登录后,您可以选择上传样本文件。使用“浏览”选项,您可以找到您的原始序列数据的上传与最大的20MB上传。
    *注:。。网站召回将只接受在一个zip ABI和SCF文件中的数据文件,tar或tar.gz文件
  3. 一旦上载的文件已被选中,选择您的参考序列。在这种情况下,可以肯定的参考序列设置为“V3”。现在您可以点击“过程数据。”
  4. 处理过的数据会出现“标题下的旧的样本。”页面右侧每个运行或样本集处理,将被放置在标有日期的文件夹。这些可以被重新标记,点击“重命名”按钮。
  5. 点击文件夹,将弹出的样本清单。是红色的那些失败,那些都是绿色的已经过去了。通过点击一个特定的样本和“查看”按钮,你可以审查序列。按照页面右侧的指示导航THROUGH序列。
    *注:对于这种方法,是可以接受的出口通过召回(以绿色显示),无需人工干预,自动序列的。
  6. 如果您对结果感到满意,你可以选择点击下载通过序列“下载”。一个压缩文件夹中的文件将被下载。
    *注:根据“设置”,您可以选择下载和电子邮件选项,包括文件类型。
  7. 未能出示清洁一式三份序列的样品应reamplified摘录一式三份。如果RePCR未能提供一个清洁的顺序,最小的2个序列向性推断是可以接受的。

9。使用Geno2pheno合作受体算法人口为基础的测序序列推断病毒嗜性。

  1. 序列可以在以下网址:http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php geno2pheno辅助受体服务贯穿。
  2. 要上传的样品可以被标注为挺直腰杆。从降下来的意​​义设置菜单,选择“从临床数据分析为基础的优化截断激励(2%和5.75%,FPR)”
  3. 选择上传或粘贴序列进行分析,FASTA文件是可以接受的的。
  4. geno2pheno FPR可以作如下解释:G2P FPR> 5.75代表一个R5的使用病毒的人口可能回应CCR5的拮抗剂G2P FPR <5.75代表非R5病毒的人口;不大可能回应CCR5的拮抗剂。 G2P <2是不太可能有任何CCR5拮抗剂的反应。如果从样品中的三个序列中的任何一个推断非R5,病人是没有可能回应到CCR5的拮抗剂。

10。代表性的成果

正确执行协议时,不要指望成功序列2个或3个,每个样品重复。样品一起运行的底片应该没有任何指示的R​​NA。大多数的序列的“通行证”召回basecalling。

基于R5和非R5社区内的病毒人口的分布,大多数的随机选择的病人样本,预计将有R5,使用病毒。因此,除非该项目的设计建议,否则,不要指望有超过非R5样品R5。

表1:A)1反应的一步法RT - PCR和B)的热循环程序要进行RT - PCR反应所需的试剂卷。

一)


试剂
量(μl)
(1X反应)
DEPC处理水 10.56
2倍的反应缓冲液 20
50%的蔗糖和0.04%溴酚蓝混合 4
正向引物SQV3F1 0.32
反向引物CO602 0.32
酶 - 标​​第三步白金Taq DNA聚合酶RT - PCR系统 0.8
共有 36

*注意:
SQV3F1引物序列:5'GAG文建会ATT CCC认证的ATA CAT达TGT的3'
CO602引物序列:5'GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC民航局GAA CC 3“

二)

循环号时间温度
1 30分钟 52℃
1 2分钟 94℃
40 15秒 94℃
30秒 55℃
1.5分钟 68℃
1 5分钟 68℃

表2 A)第二轮PCR反应1和B)的热循环程序要进行第二轮PCR反应所需的试剂卷。

一)


试剂
量(μl)
(1X反应)
DEPC处理水 13.45
60%的蔗糖,0.08%甲酚红混合 2
罗氏公司的HiFi系统缓冲区2 2
氯化镁 0.8
的dNTP 0.16
正向引物SQV3F2 0.15
反向引物CD4R 0.15
展开高保真酶 0.29
共有 19

*注意:
SQV3F2引物序列:5'TGT的海湾合作​​委员会共同国家评估GCT GGT TTT GCG在3'
CD4R引物序列:5'达亚洲空运中心TCA铁通反恐委员会民航局TTG TCC的3'

二)


循环号
时间温度
1 2分钟 94℃
35 15秒 94℃
30秒 55℃
1分钟 72℃
1 7分钟 72℃

表3 A)1测序反应和二)热循环程序要进行测序反应所需的试剂卷。

一)

试剂 量(μl)
(1X反应)
BigDye 0.3
BigDye缓冲区 2.1
底漆
远期V3FO2F
反向SQV3R1
2.6
共有 5.0

*注意:不要将引物,引物各准备一个单独的组合应
V3O2F引物序列:5'亚洲空运中心GTC的AGY ACA的多伦多民航局的TGT ACA的C 3“
SQV3R1引物序列:5'GAA TTC AAA级CCT TCC ACA的AT&T AAA级3“

二)


循环号
时间温度
25 10秒 96℃
5秒 50℃
55秒 60℃

Discussion

这里介绍的方法是一个标准的测序方法应用于向性测试。 HIV包膜V3循环测序预测病毒嗜性的临床应用,直到深夜被限制。 maraviroc(欢跃医疗)临床试验的回顾性分析,此方法已被证明至少同样能够预测病毒嗜性,在临床上常用的其他验证分析比较。

有许多好处执行向性预测V3环的基因型分析。首先,这个程序可以在任何设施进行经营的测序设备,大大增加了获取和减少周转时间向性测试。相比较而言,表型增强敏感性Trofile含量(ESTA)(的Monogram Biosciences公司),其中有向性测试的黄金标准,是在南加州的一个中心。其他好处包括要求的起始原料和最低要求的血浆病毒载量的500copies/mL。同时,运行的基因型检测的营运成本相对较低的表型检测的比较。召回的软件的使用,特别是消除了手动顺序审查的要求,这往往是一个劳动力密集的基因型分析。

这里介绍的方法非常简单,没有特别的又一步骤抵销的重要性。我们建议运行PCR和测序,一式三份,以增加病毒样本人口内捕捉少数物种的可能性。可进行复制大于3,但是我们已经发现一式三份,高效,可靠的。我们也建议采用一步到位逆转录PCR试剂盒(QIAGEN)执行同样的反应,同时保持高灵敏度和特异性都RT - PCR和第一轮PCR。

Disclosures

P.理查德哈里根欢跃医疗保健,Virco,默克,雅培,和Quest的利益冲突。此视频文章是由欢跃医疗赞助。

Acknowledgments

这个实验的发展是支持欢跃医疗保健和卫生研究所(CIHR)加拿大研究所和葛兰素史克公司在临床病毒学博士哈里根/ CIHR主席通过。

由辉瑞和Viiv医疗提供支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica bioMerieux cat. # 280133 (48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer bioMerieux cat. # 280134 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 bioMerieux cat. # 280130 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 bioMerieux cat. # 280131 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 bioMerieux cat. # 280132 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0 bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water Ambion cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty Invitrogen cat#12574-035 Kit components used:
- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix
- 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System Roche Group cat. # 1 759 078 Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP Roche Group cat. # 11969064001 (100 mM)
Sucrose Sigma-Aldrich cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt Sigma-Aldrich cat.# B5525
Cresol Red Sigma-Aldrich cat.# 114472-5G indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer Invitrogen cat. # 24710030 (1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen cat. # S33102
Agarose (ultra pure) Invitrogen cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder Invitrogen cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosciences cat. # 4337458 (25000 reactions)
Hi-Di Formamide Applied Biosciences cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc) Sigma-Aldrich cat. # S-2889
EDTA Sigma-Aldrich Cat.# 03690-100ML 0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution Sigma-Aldrich cat. # T-2819 1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. # M-1028 1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA Applied Biosystems cat. # 4335613 500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) Applied Biosystems cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit Applied Biosciences Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer Applied Biosciences

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References

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Comments

1 Comment

  1. Very Cool!!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 7, 2011 - 11:46 AM

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