Трансдукция клеток человека с Полимер-комплекс Ecotropic лентивирус для работы с улучшенными биобезопасности

Published 7/24/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Лентивирусов являются ценным исследовательским инструментом для изучения функции генов, однако, исследователи, возможно, пожелают, чтобы избежать производства пантропный кодирования лентивирус известных или подозреваемых онкогенов. В качестве альтернативы, мы представляем безопаснее протокол для использования ecotropic лентивирус на клетки человека изменен, чтобы выразить ecotropic mSlc7a1 рецепторов.

Cite this Article

Copy Citation

Barrilleaux, B., Knoepfler, P. Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety. J. Vis. Exp. (53), e2822, doi:10.3791/2822 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Discussion

Рекомбинантный ecotropic gammaretrovirus на основе Молони мышиного вируса лейкоза (MLV) и его рецептор mSlc7a1 хорошо изучены и широко доступны, что оно использовалось более 20 лет для доставки трансгенов в мышиных клетках. Ecotropic gammaretrovirus также используется в последнее время для доставки онкогенов в клетках человека;. В контексте сотовых перепрограммирования, использование mSlc7a1, чтобы избежать поколения amphotropic вирус укрывательство человека онкогенов хорошо известна 4,5 Тем не менее, лентивирус обеспечивает значительные преимущества по сравнению с gammaretrovirus В трансдуцирующих огнеупорных клеточных популяций, 6, включая первичные клетки, которые часто желательно цели для перепрограммирования, так как лентивирусов предварительной интеграции комплекса позволяет трансдукции, не делящихся клеток. 7

Лентивирусов были произведены с десятками различных pseudotypes, в том числе MLV, в попытке изменить вирус тропизм, токсичность и другие свойства. 8 MLV-pseudotyped ecotropic лентивирус была использована для трансдукции клеток мыши, 9, но редко используется на клетки человека 10. Поэтому мы предлагаем использование MLV-pseudotyped ecotropic лентивирус как безопасный, экономичный и высокоэффективный автомобиль для доставки известных или подозреваемых онкогенов, в том числе сотовых перепрограммирования факторов, в клетках человека.

Важно отметить, что этот протокол не полностью избавляет от необходимости производить и использовать пантропный лентивирус, а, скорее, этот протокол отделяет онкоген (ы) из пантропный вирус, изоляционные исследователей из потенциальных самостоятельной прививки связанных с раком вирусов. MSlc7a1 белка и его гомолог человеческого hSlc7a1 являются повсеместно выразил аминокислоты перевозчиков кислоты, не известны туморогенность или способность даровать селективное преимущество роста на клетки-реципиенты, 11 решений mSlc7a1 сравнительно низким уровнем риска для включения в amphotropic вируса. Это добавило шаг может быть особенно полезным в лабораториях не хватает посвященный вирусу или объектов культуры тканей необходимого уровня биобезопасности.

В некоторых ситуациях это может быть возможным, чтобы полностью отказаться от использования пантропный вируса путем трансфекции плазмидой Slc7a1 непосредственно в клетки-мишени, однако многие клетки, которые были бы полезными целями этой техники также поддаются трансфекции. В качестве альтернативы, способность изолировать Slc7a1-трансдуцированных клеток выбор blasticidin означает, что VSV-G pseudotyped лентивирус может быть использован только один раз, чтобы создать запас рецепторами клеток, экспрессирующих, после чего ecotropic вирус может быть использован для трансдукции обычно эти клетки для многих экспериментов. Исследователи должны всегда следовать их институциональных правил техники безопасности при работе с любым лентивирус, независимо от его тропизм.

Титры ecotropic вируса достигнуты с этим протоколом умеренно ниже, чем VSV-pseudotyped вирус, как правило, 10-20% пантропный титр вируса, в соответствии с предыдущими исследованиями. 9 Эти титры были измерены в клетках человека стабильно трансдуцированных с Slc7a1, так что нижняя наблюдается титр для ecotropic вирус может быть частично обусловлено разнообразными экспрессии рецептора гена в клетки-мишени. Тем не менее, вирусные титры достигнута в наш протокол более чем достаточно для большинства приложений и привести к трансдукции большинства клеток, в некоторых случаях> 90% клеток.

Центрифугирование методы на основе широко используются для сконцентрироваться вирусных частиц. Тем не менее, центрифугирования требует нескольких часов, генерирует инфекционных аэрозолей, и может привести к значительной потере вирусных частиц. 12 В качестве альтернативы, комплексообразование с НЦБ / PB может быть использован для повышения трансдукции без изменения вирусной тропизм. 3 Этот метод быстрого (5 минут ) и недорогая ($ 0,03 за 10 мл вируса), в то время как примерно в три раза наблюдалось титр. Никакого специального оборудования или собственности реагенты необходимы, и мы наблюдали минимальную острую токсичность после воздействия HDFS для CS / PB, по согласованию с предыдущей работы в других клеточных линий. 13 Одним из потенциальных недостатков этого протокола является то, что некоторые микроскопически видимые полимерных комплексов придерживаться клетки в течение нескольких дней в культуре. Мы не можем исключить возможность того, что эти комплексы, а не открыто токсичны для клеток, может иметь более тонкие эффекты на клеточные процессы.

Здесь мы описали методологию безопасно и эффективно трансдуцирующих человеческие клетки с онкогенными факторами. Этот подход должен быть очень утилита для исследователей, изучающих онкогенов и биологии стволовых клеток, в том числе плюрипотентных клеток.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Финансирование этого проекта была предоставлена ​​Калифорнийского института регенеративной медицины.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV receptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G envelope
pCMV-dR8.91 Addgene D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-Ec–nv Addgene 15802 Ecotropic envelope
FUGW Addgene 14883 GFP control plasmid
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche Group 04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma-Aldrich C4384
Blasticidin S Fisher Scientific BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats