Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir tanıtmak

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ueki, S., Lacroix, B., Citovsky, V. Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (54), e2961, doi:10.3791/2961 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Validating farklı proteinler arasındaki etkileşimleri, moleküler düzeyde kendi biyolojik fonksiyonları incelenmesi için hayati önem taşımaktadır. Proteine ​​bağlanma in vitro ve in vivo olarak değerlendirmek için, çeşitli yöntemler vardır ve birbirlerinin eksikliklerini tamamlayacak en az iki yöntem güvenilir bilgiler elde etmek için yapılmalıdır.

In vivo tayininde, iki moleküllü floresan tamamlama (BiFC) tayini, canlı hücre içerisinde protein-protein etkileşimleri algılamasını sağlar en popüler ve en az invaziv bir yaklaşımı temsil ediyor, hem de etkileşen proteinler 1,2, hücre içi lokalizasyonu belirlemek için. Bu testte, GFP veya türevleri olmayan floresan K ve C-terminal yarıya iki füzyon proteinleri test proteinler 'etkileşimleri nedeniyle bir araya getiren ne zaman test proteinler erimiş, ve floresan sinyal 3-6 sulandırılmış. . Çünkü sinyali Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile kolayca tespit edilebilir, BiFC hücre biyologlar arasında seçim canlı hücreler 3 protein-protein etkileşimleri hakkında eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu testte, ancak, bazen yalancı pozitif sonuç üretebilir. Örneğin, floresan sinyal daha ziyade bu spesifik etkileşimler nedeniyle 7, küçük bir hücre içi kompartmanda ambalaj yakın nedeniyle her bildiğim kadarıyla 7 nm düzenlenmiş iki GFP parçaları ile sulandırılmış olabilir.

Bu sınırlamalar nedeniyle, canlı hücre görüntüleme teknolojilerinden elde edilen sonuçlar, protein etkileşimleri tespit etmek için farklı bir prensip dayalı bağımsız bir yaklaşım tarafından teyit edilmelidir. Co-immunoprecipitation (Co-IP) ya da glutatyon transferaz (GST) açılan deneyleri, in vitro protein-protein etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılır gibi alternatif yöntemler temsil eder. Ancak, bu testlerin iin, ancak, test edilen proteinleri bağlama reaksiyon supportsused tampon kolayca çözünür olmalıdır. Bu nedenle, spesifik etkileşimler çözünmeyen bir protein içeren bu tekniklerin tarafından değerlendirilmelidir.

Burada, biz bu zorluğu circumvents protein membran kaplama bağlayıcı testi için protokol göstermektedir. Bu teknikte, çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşim, bir zar matriks proteinleri biri üzerinde hareketsiz çünkü güvenilir bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, in vivo deneyler, bu tür BiFC ile birlikte, sadakatle çözünür ve çözünmez proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek ve karakterize etmek için güvenilir bir yaklaşım sağlar. Bu makalede, Tütün mozaik virüsü (TMV) arasında viral hücre-hücre 8-14 taşıma sırasında birden çok işlevi uygular hareket protein (MP), ve kısa bir süre önce tanımlanmış bitki hücresel interactor, tütün ankyrin tekrar içeren protein bağlama (ANK 15), bu tekniği kullanarak gösterilmiştir.

Protocol

1. İfade ve proteinlerin ekstraksiyonu

  1. Farklı şekillerde kendi tespiti için test edilmesi proteinler etiketi. Membran (ProIM), daha büyük boyutta (örneğin, GST) bir etiket ile immobilize ve halkaya yapışmamış etiketi hareketsiz bir negatif kontrol (ProIMnc) olarak kullanılabilir protein etiketleyin. Ya büyük ya da küçük bir etiket ile çözünebilir bir prob (ProSOL) olarak kullanılmak üzere protein etiketleyin. Aynı etiket uygun bir negatif kontrol çözünür protein (ProSOLnc) Sigorta ve tespit edilen bağlama özgüllüğü onaylamak için etkileşim tahlil dahil.
  2. Etiketli proteinleri ifade etmek protein ekspresyon sistemi, yani E. seçin coli, bakülovirüs vb proteinler potansiyel mesaj translasyonel modifikasyonlar ve verim için ihtiyaç bağlı olarak.
  3. SDS-PAGE proteinaz inhibitörü kokteyl içeren yükleme tamponu (% 20 gliserol,% 4 SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) kullanarak seçim organizma (adım 1.2) ProIM ve ProIM nc ayıklayın. Hücre süspansiyonu bırakın, 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 merkaptoetanol ve 5 dakika boyunca kaynatın% 0.5 'i ekleyin.
  4. ProSOL ve ProSOL nc, standart protokolleri 16 kullanarak seçim organizma (adım 1.2) ayıklayın . Bu proteinler adım 4.1 (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT,% 1 BSA,% 0.1 Tween 20) bağlayıcı tampon kolayca çözünür olmalıdır.
  5. Bio-Rad protein tahlil kiti standart bir yöntem kullanılarak rekombinant proteinlerin konsantrasyonu belirleyin. Bio-Rad protein tahlil kiti gibi. Proteinin saflaştırılmış yerine ham özü, tahlil için kullanılması durumunda, Coomassie Brillant Blue R-250 ile ilgili bant densitometrisi SDS-poliakrilamid jel boyanmış ve bilinen kullanarak bu özü ilgi protein konsantrasyonu tahmin referans olarak BSA konsantrasyonları.

2. Membran ProIM ve ProIMnc immobilizasyonu

  1. Özler, standart bir protokol 16 göre, SDS-poliakrilamid jel üzerinde ProIM ve ProIM nc 1 mcg içeren her iki takım giderin .
  2. Elektroforez sonra, 100 ml (60 mM Glisin, 10 mM Tris,% 0.0006 SDS,% 20 MeOH) transfer tampon transferi jel yerleştirin ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe.
  3. Nitroselüloz membrana göre standart bir protokol 16 jel bulunan proteinler Electrotransfer.

3. Membrana bağlı proteinler Re-katlama

  1. Electrotransfer sonra, 15 dakika için 15 ml tampon membran inkübe A (30 mM Tris-HCl pH7.4,% 0.05 Tween 20) artık SDS kaldırmak için yavaşça sallanarak.
  2. Dikkatli bir şekilde boşaltılmasının ardından, denatürasyon tampon (7 M guanidin hidroklorür, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3) 25 ml membran aktarın. ve yavaşça sallanarak 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. (Not: denatürasyon tampon inkübe nitroselüloz membran bulanıklaşır). ve yavaşça sallanarak 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. 25 TBS ml (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) ve 5 dakika boyunca hafif ajitasyon ile inkübe membran Devret (Not: Bu adım sırasında, orijinal beyaz renkli membran kavuşur).
  4. Membran bağlayıcı tampon 25 ml (1.2 adım) transferi ve 4 ° C yavaşça sallanarak gece boyunca inkübe edin.

4. ProSOL tarafından ProIM problama

  1. Iki şeritler, hem de içeren ProIM ve ProIM nc membran kesin.
  2. 10 ml taze bağlayıcı tampon ProSOL veya ProSOLnc 1-10 mikrogram ile hazırlık seyreltilmesi ProSOL ve ProSOLnc hibridizasyon çözümleri olun. ProSOL veya ProSOLnc hibridizasyon çözümü her membran transferi ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
  3. Hibridizasyon çözümler membranlar çıkarın ve 15 dakika TBS içinde her biri için üç kez yıkayın.

5. Immün protein-protein etkileşim görselleştirme

  1. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle TBST% 2,5 yağsız süt (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl,% 0.05 Tween 20, pH 7.4) ile membran engelleyin. TBST% 0,5 yağsız süt üretici tarafından önerilen konsantrasyonda birincil antikor (anti-strepII poliklonal tavşan antikoru) sulandırınız.
  2. Antikor çözüm bloke membranlar yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca inkübe 4 ° C yavaşça sallanarak.
  3. 15 dakika için 20 ml TBST membranlar durulayın ve iki kez yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 5 dakika.
  4. TBST% 0,5 yağsız süt üretici tarafından önerilen konsantrasyonda at turp peroksidaz (HRP) ile konjuge sekonder antikoru (anti-tavşan IgG) sulandırınız. Membranlar ikincil antikor yerleştirinçözüm ve yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
  5. 15 dakika için 20 ml TBST membranlar durulayın ve iki kez yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 5 dakika. TBS son durulama sonra, HRP kemilüminesans substrat (örneğin, Millipore Immobilon batı kemilüminesan HRP substrat) kullanarak protein-protein etkileşimleri görselleştirmek.
  6. 5.4 adımları 5.1 'de açıklanan uygun ikincil antikor takip ProIM, erimiş etiketi için birincil antikor ile aynı membranlar Prob. Görselleştirin ProIM ve ProIMnc protein membran kaplama assay (adım 5.5) elde edilen bantların kimliğini doğrulamak için 5.5 adımı nitelendirdi. Çoğu durumda, bu adımı ile elde edilen sinyal adım 5.5 'ten elde edilen kalıntı sinyali daha güçlü çünkü sıyırma, gerekli değildir.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

ANK-MP etkileşim tütün epidermal hücreler (Şekil 1A) BiFC gözlendi. MP, bakteri veya bitkilerde ifade yüksek çözünmeyen bir protein olduğu için, protein membran kaplama testi, in vitro (Şekil 1B) bu etkileşimin doğrulamak için kabul edildi. GST-MP (ProIM) veya halkaya yapışmamış GST (ProIM nc) 1 mg protein özleri içeren bir nitroselüloz membran electrotransfer takip SDS-poliakrilamid jel elektroforezi, çözüldü. Bu ProIMs çözünür ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, ancak halkaya yapışmamış değil GST probed bağlayıcı sergilenmektedir (Şekil 1B, hat 1, 2, 5, 6 şeritli karşılaştırın). Ayrıca, aynı ProIMs ANK-MP etkileşim özgüllüğü (Şekil 1B, daha gösteren bir ilgisi olmayan ProSOLnc, yani strepII (NADH3-strepII) etiketli Arabidopsis sitoplazmik NADH kinaz, hiçbir bağlayıcı gözlenmemiştir ile probed şerit 3, 4).

Şekil 1
Şekil 1, in vivo ve in vitro TMV MP tütün ANK Özgül bağlayıcıdır . (A), BiFC tarafından tespit edilen tütün epidermal hücrelerin yaşam ANK-MP etkileşim. MP ve ANK, C-terminal ve sırasıyla YFP N-terminal yarısı erimiş Güçlü YFP sinyali kodlayan genlerin microbombardment tütün epidermiste coexpressed, yeniden inşa edildi. Bu BiFC sinyal plasmodesmata 15 tanı hücre çevre, puncta birikmiş. (B) in vitro ANK-MP etkileşim gibi protein membran kaplama yöntemi ile tespit edildi. GST-MP (ProIM) veya halkaya yapışmamış GST (ProIMnc) 1 mg protein özleri içeren bir nitroselüloz membran üzerine electrotransfer% 15 SDS-poliakrilamid jel, çözüldü. GST-MPProIM ve GSTProIMnc ANK-strepII (ProSOL) 0.5 mg / ml ile inkübe edildi ve ANK bağlama konjuge anti-tavşan IgG + M sekonder antikoru, anti-strepII tavşan poliklonal antikor ile membran problama tespit edildi HRP (1 ve 2 şeritli). GST-MPProIM ne GSTProIMnc ne strepII etiketi (ProSOLnc, şerit 3 ve 4) erimiş alakasız bir protein, Arabidopsis sitoplazmik NADH kinaz ile etkileşim. Bu testte gözlenen grubun kimliğini anti-GST antikor (şerit 5 ve 6) ile membran problama tarafından teyit edildi. ANK-strepII GST-MP ve GST contining protein özleri bulunan kimliği belirsiz proteinler ile reaksiyona membran tampon A ile yıkanır olmadan denatürasyon tamponu ile tedavi edildi, GST-MP ANK bağlama önemini gösteren, kaybolur 3.1 adım önce denatürasyon süreci (şerit 7 ve 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yaklaşım, proteinler en az bağlayıcı tampon kolayca çözünür olduğu ve diğer proteinlerin kombinasyonu 17,18 başarıyla uygulandı proteinler kombinasyonları arasında protein-protein etkileşimleri, test etmek için uygundur . Bu koşullar altında hem de çözünmez proteinler arasındaki iInteractions Bu protokol tarafından test edilemez.

Ayrıca, başarılı refolding ProIM testi için kritik öneme sahiptir. Kalan SDS denatürasyon / Yeniden doğallaştırmanın sürecini etkilememeli çünkü electrotransfer sonra TBS membran Durulama, önemli bir adımdır.

Son olarak, non-spesifik bağlama önlemek için, bağlayıcı tampon ProSOL konsantrasyonu 1 mcg / ml 'yi geçmemelidir. Çok konsantre ProSOL ProIM non-spesifik bağlama gösterebilir. Ayrıca, adım 4.2 sırasında kullanılan hibridizasyon tamponu ProSOL BSA membran immobilize proteinlerin non-spesifik bağlama engellemek için kaymaksız süt ikame edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Laboratuarda çalışma NIH, ABD Tarım Bakanlığı Gıda ve Tarım Ulusal Enstitüsü, NSF, BARD, Enerji Bakanlığı ve BSF VC hibe tarafından desteklenmektedir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein assay kit Bio-Rad 500-0001
Proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich S8820
Mini-PROTEAN system Bio-Rad 165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system Bio-Rad 170-3940
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase GenScript A00098
Anti-GST rabbit polyclonal antibody GenScript A00097
Anti-strepII GenScript A00626
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane Pall Corporation 27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate EMD Millipore WBKL S0 050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
  2. Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  3. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  4. Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
  5. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
  6. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  7. Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
  8. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
  9. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  10. Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
  11. Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
  12. Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
  13. Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
  14. Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
  15. Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
  16. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  17. Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
  18. Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).

Comments

1 Comment

  1. how i can make experiment about proteins ?
    what are the proteins reactions?the reactants and products and tools and the methods od the experiments ?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 1:06 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics