增加从单细胞的数量标准实验室逆转录反应的mRNA的cDNA产量,使用声Microstreaming

Bioengineering

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Summary

我们描述了一个从单细胞的mRNA数量增加在其他标准的实验室逆转录反应的cDNA产量的新方法。求新驻留在一个微混合器的使用,它采用的声学microstreaming现象,微升尺度混合流体比摇晃,震荡或trituration更有效。

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Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., Zhu, Y., Manasseh, R., Horne, M. K., Aumann, T. D. Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming. J. Vis. Exp. (53), e3144, doi:10.3791/3144 (2011).

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Abstract

细胞的行为及其相关基因表达的理想是做在单细胞水平。然而,这是不容易实现的,因为少量不稳定的mRNA在一个单元格(1 - 50pg总RNA的1-5%,或0.01 - 2.5pg的mRNA,每单元 1)目前大多降低,然后才可以反转录进入一个稳定的基因复制。例如,使用标准的实验室试剂和硬件,只有少数基因可以定性评估每单元 2 。一种方式来提高效率标准的实验室逆转录(RT)的反应,包括单细胞mRNA的金额(即标准试剂微升卷)将更加迅速地混合使用的试剂,使可转换的mRNA为cDNA,然后它会降低。然而,这是不平凡的,因为在微升尺度液体流动层,即目前可用混合方法(即晃动,涡旋和trituration)不能产生足够的混沌运动,有效地组合试剂。为了解决这个问题,微观尺度的混合技术也将用于 3,4 。已开发的基于微流体混合技术,成功地增加RT反应产 5-8 。然而,微流体技术需要专门的硬件是相对昂贵,尚未广泛使用。一个更便宜,更方便的解决方案是可取的。这项研究的主要目的是演示了如何应用小说“的微观”的技术标准实验室RT反应包括单细胞的mRNA数量大大增加了他们的cDNA产量。我们发现cDNA的产量增加约10 - 100倍,从而使:(1)更大的数字分析每个细胞的基因;(2)基因表达的定量分析;(3)更好的低丰度基因检测在单细胞。的微观是基于声microstreaming 9-12,声波传播围绕一个小的障碍,创建一个障碍物附近的平均流量的现象。我们已经开发出一个关键的简化声microstreaming为基础的装置(“微混合器”);声microstreaming可以确保系统中有一个小半径曲率 13的液气界面在音频实现。在管的解决方案微升量的半月板提供了一个适当的曲率半径小。音频频率的使用,意味着硬件可以廉价和通用的13,和不被损坏,像他们可以与标准实验室sonicators核酸和其他生化试剂。

Protocol

1。微观一个RT反应

  1. 在执行与RT反应的微​​观,RT反应所需的温度平衡的微混合器。
    1. 将微混合器内的37 ° C(或由RT供应商建议的温度)RT反应发病前至少1小时的孵化器。
  2. 根据逆转录供应商设置的RT组合(例如,自Qiagen Omniscript自Promega MMTV - RT)的说明,除了使用单细胞的金额,输入的总RNA(例如0.1-1pg/μl),而不是毫微微克供应商建议的数额。
    1. 我们使用标准的无菌,无核酸200μL薄壁PCR管。
  3. 位置RT管牢固地进入微混合器尽快搅拌。 RT反应时间应保持37℃孵化器内的微混合器。
  4. 选择适当的频率和幅度的微观混合。在这个例子中,我们使用150Hz的。
  5. 开关的微混合器,离开它为整个工期的RT反应(60分钟)。
  6. 开关的微混合器和采取的RT管RT反应完成后。
  7. 放在冰RT管,并进行进一步的应用,如定量聚合酶链反应(定量PCR或实时PCR)为正常。

2。代表性的成果:

在逆转录反应中的微观的好处是在使用时,其他的混合方法(如摇晃,震荡或trituration)cDNA的产量相对增加。可以看出,例如,随后的cDNA用定量聚合酶链反应(定量PCR或实时PCR)分析后。图2a给出了第5分钟的微观效应(蓝色,“micromixed5”)或整个60分钟(红色,“micromixed60”)与RT反应trituration前夕的RT孵化(黑色,“trituration相比” )。在这种情况下,前面的RT反应体积为25μL,它包含2.5pg的总RNA。如上图所示,使用的引物设计到检测的cDNA代表Nurr - 1的mRNA的qPCR的痕迹和手段±周期,以达到在3重复这同样的实验50%的最大荧光中小企业绘制如下。星号表示差异有统计学意义(单向方差分析与杜克多重比较)。注意,前面的RT反应的前5分钟的微观生产比trituration非显着改善,而整个60分钟前RT反应的微​​观产生了显着的改善超过trituration,幅度约相当于15的qPCR周期,平均。

对微观混合的好处,也可以看出,在随后的qPCR产品获得熔解曲线分析。在图2b所示的实验,为整个60分钟前RT反应的微​​观导致在重复样本的qPCR信号(图2BA,2个红色的痕迹),而第5分钟,或只产生不一致的qPCR trituration的微观痕迹(图2BA,2个蓝色的痕迹和2个黑色的痕迹,分别)。灰色的痕迹,阴性对照组(“南德”)在其中的cDNA的qPCR反应。当从本实验的qPCR产品,通过提高他们的温度(即熔解曲线分析),它是明显的变性,适当的PCR产物(即是相同的,当浓度高得多的mRNA反转录和定量PCR扩增获得的扩增,数据未显示),目前只有以下RT,已为60分钟(图2BB,2个红色的痕迹)micromixed的反应。所有其他人(即micromixed5,trituration阴性对照)所产生的替代扩增产品(如引物二聚体)。

图1
图1。申请的微观标准实验室RT反应的协议的流量图。涉及的物理原理,在微混合器,以及如何建立一个内部的微混合器提供更详细的描述中引用13,14

图2
图2代表的qPCR数据显示的微观应用到前面的逆转录反应,包括在其他标准的实验室逆转录反应的单细胞的mRNA数量的好处 。一个比方的qPCR检测的cDNA代表Nurr - 1基因的mRNA编码的痕迹。前面的RT反应在25μL体积的总RNA中包含2.5pg,并在37℃,60分钟,在一个孵化器。逆转录反应混合的R triturationT组合前潜伏期(黑的痕迹,“trituration”),micromixed RT反应(蓝色的痕迹,“micromixed5”)在第5分钟,或为整个60分钟的RT反应micromixed的(红色的痕迹,“micromixed60” )。平均值±中小企业的数量要求达到50%,最大荧光定量PCR周期曲线所示为n = 3的重复这个实验。星号表示显着性差异(单程与杜克多重比较方差分析)。 另一个qPCR的实验研究Nurr - 1基因的产品,这个时候包含在一个体积25μL25pg总RNA逆转录反应。 qPCR的痕迹(一)以及熔解曲线分析定量PCR获得的产品(B)所示为不同的搅拌条件下。还包括在没有基因包含在前面的RT反应的阴性对照(灰色的痕迹,“负”)。浓度高得多的mRNA RT反应也和生产micromixed60(二)(红色痕迹)样品相同熔解曲线峰(数据未显示)。

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Discussion

应用标准实验室RT反应的微​​观描述的方法可以,当然,涉及的mRNA通过任何方法(如细胞裂​​解,激光捕获显微切割)的收获。它也可以包括任何品牌或类型的RT试剂,任何温度(微混合器的材料的承受能力范围内),和任何时期。例如,我们已经看到了包括随机六聚体或寡DT引物的RT反应的cDNA产量提高。它也可能被应用到其他生化转换(例如DNA杂交15),符合以下限制。当前技术的主要制约因素是必须发生在一个小的(微升)解决方案的下降,形成一个弧形的液体空中接口(如半月板)的反应。我们经常使用卷10或25μL,200μL薄壁PCR管生产半月板分别为4.7或6.9毫米,曲率半径。这是一个在下降,从而拉长了不同的解决方案之间的接口设置一个旋涡流的要求,并允许扩散到地方在较短的时间尺度。这个约束,因此,适用于所有可能被用来在其中的微观情况。事实上,使用小卷可以是一个优势,因为往往是输入材料(如RNA,DNA)的数量是有限的,加上其他试剂可以大大节省。在特定背景下的RT反应产率提高,反应也必须包括一个mRNA的限制金额。我们已经表明的微观标准实验室RT反应,包括输入RNA的单细胞数量增加搅拌(摇晃,震荡或trituration),包括Nurr - 1说明以外的其他基因的标准方法,约10 - 100倍的cDNA产量这里14。我们还表明,这种改进降低输入RNA的浓度增加14。想必这是因为在较高的RNA浓度,增加扩散率的微观混合的情况下,确保更多的基因是转化为cDNA,它会降低之前。

微观混合的方法,将受益于高高保真通过反应釜反应液的声信号的传输。我们帮助实现小心混合覆亚克力板扬声器(图1),他们正是适合的200μL薄壁PCR管锥孔加工。这最大化之间的接触管和亚克力板,因此最大化的声信号的传输。人们也需要,以确保安全反应管内混合孔举行,因为他们可以在混合的机械振动。

我们声学microstreaming的定义是可能比一些现象学为基础的定义更广泛。然而,有一个良好莱利16的根本,而不是现象学,审查,分类这些流动。 Navier - Stokes方程的非线性项,已足够大,以便在第二为了有一个平均流量。由于这个词是一个速度倍速度梯度,我们做任何使速度变化足够小尺度(即足够大的速度梯度),可以带来一个microstreaming流。我们的声学microstreaming为基础的装置(“微混合器”)能够在音频频率(即低功耗),确保系统中有一个小半径曲率 13的液气界面声microstreaming。相比之下,“声流”往往是定义一个非线性项是由一个大的速度(即高功率)大。在我们的例子,在一个良好的小水滴是由振荡;连同其粘度,表面张力下降,可能会发挥创造了平均流量为混合 13的作用。实验还表明,大型(10 -100μm的)粒子可在 ​​振动较大的下降比我们使用的移动,但是这可能是由不同的机制, 具体到粒子17。

总之,应用的微观标准实验室RT反应,包括单细胞的RNA金额大幅增加他们的cDNA产量的有效途径。这种改进及以上的混合微升卷使用目前可用的方法(即摇晃,震荡或trituration),可以实现。虽然有很多情况下,在微流体为基础的设备,执行RT将是一个巨大的进步,在其他情况下,包括我们自己的,单独的微观提供显着的和足够的利益,而不需要作进一步的专门设备和方法。

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Disclosures

作者们没有透露。

Acknowledgments

这项研究得到国家卫生和医学研究理事会澳大利亚(项目赠款。6288480)和Scobie和克莱尔麦金农信托。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit Arcturus Bioscience KIT0204 The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents Ambion AM1906M
Random hexamer primers Promega Corp. C1181
AMV-RT Promega Corp. M5101
dNTP set Promega Corp. U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega Corp. N2111
Nuclease-Free Water Promega Corp. P1193
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer. Thermo Fisher Scientific, Inc.
Corbett Rotor Gene RG-6000 Corbett Life Science Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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