Summary
我们描述了一个从单细胞的mRNA数量增加在其他标准的实验室逆转录反应的cDNA产量的新方法。求新驻留在一个微混合器的使用，它采用的声学microstreaming现象，微升尺度混合流体比摇晃，震荡或trituration更有效。
Abstract
细胞的行为及其相关基因表达的理想是做在单细胞水平。然而，这是不容易实现的，因为少量不稳定的mRNA在一个单元格（1 - 50pg总RNA的1-5％，或0.01 - 2.5pg的mRNA，每单元 1）目前大多降低，然后才可以反转录进入一个稳定的基因复制。例如，使用标准的实验室试剂和硬件，只有少数基因可以定性评估每单元 2 。一种方式来提高效率标准的实验室逆转录（RT）的反应，包括单细胞mRNA的金额（即标准试剂微升卷）将更加迅速地混合使用的试剂，使可转换的mRNA为cDNA，然后它会降低。然而，这是不平凡的，因为在微升尺度液体流动层，即目前可用混合方法（即晃动，涡旋和trituration）不能产生足够的混沌运动，有效地组合试剂。为了解决这个问题，微观尺度的混合技术也将用于 3,4 。已开发的基于微流体混合技术，成功地增加RT反应产率 5-8 。然而，微流体技术需要专门的硬件是相对昂贵，尚未广泛使用。一个更便宜，更方便的解决方案是可取的。这项研究的主要目的是演示了如何应用小说“的微观”的技术标准实验室RT反应包括单细胞的mRNA数量大大增加了他们的cDNA产量。我们发现cDNA的产量增加约10 - 100倍，从而使：（1）更大的数字分析每个细胞的基因;（2）基因表达的定量分析;（3）更好的低丰度基因检测在单细胞。的微观是基于声microstreaming 9-12，声波传播围绕一个小的障碍，创建一个障碍物附近的平均流量的现象。我们已经开发出一个关键的简化声microstreaming为基础的装置（“微混合器”）;声microstreaming可以确保系统中有一个小半径曲率 13的液气界面在音频实现。在管的解决方案微升量的半月板提供了一个适当的曲率半径小。音频频率的使用，意味着硬件可以廉价和通用的13，和不被损坏，像他们可以与标准实验室sonicators核酸和其他生化试剂。
Protocol
1。微观一个RT反应
- 在执行与RT反应的微观，RT反应所需的温度平衡的微混合器。
- 将微混合器内的37 ° C（或由RT供应商建议的温度）RT反应发病前至少1小时的孵化器。
- 根据逆转录供应商设置的RT组合（例如，自Qiagen Omniscript自Promega MMTV - RT）的说明，除了使用单细胞的金额，输入的总RNA（例如0.1-1pg/μl），而不是毫微微克供应商建议的数额。
- 我们使用标准的无菌，无核酸200μL薄壁PCR管。
- 位置RT管牢固地进入微混合器尽快搅拌。 RT反应时间应保持37℃孵化器内的微混合器。
- 选择适当的频率和幅度的微观混合。在这个例子中，我们使用150Hz的。
- 开关的微混合器，离开它为整个工期的RT反应（60分钟）。
- 开关的微混合器和采取的RT管RT反应完成后。
- 放在冰RT管，并进行进一步的应用，如定量聚合酶链反应（定量PCR或实时PCR）为正常。
2。代表性的成果：
在逆转录反应中的微观的好处是在使用时，其他的混合方法（如摇晃，震荡或trituration）cDNA的产量相对增加。可以看出，例如，随后的cDNA用定量聚合酶链反应（定量PCR或实时PCR）分析后。图2a给出了第5分钟的微观效应（蓝色，“micromixed5”）或整个60分钟（红色，“micromixed60”）与RT反应trituration前夕的RT孵化（黑色，“trituration相比” ）。在这种情况下，前面的RT反应体积为25μL，它包含2.5pg的总RNA。如上图所示，使用的引物设计到检测的cDNA代表Nurr - 1的mRNA的qPCR的痕迹和手段±周期，以达到在3重复这同样的实验50％的最大荧光中小企业绘制如下。星号表示差异有统计学意义（单向方差分析与杜克多重比较）。注意，前面的RT反应的前5分钟的微观生产比trituration非显着改善，而整个60分钟前RT反应的微观产生了显着的改善超过trituration，幅度约相当于15的qPCR周期，平均。
对微观混合的好处，也可以看出，在随后的qPCR产品获得熔解曲线分析。在图2b所示的实验，为整个60分钟前RT反应的微观导致在重复样本的qPCR信号（图2BA，2个红色的痕迹），而第5分钟，或只产生不一致的qPCR trituration的微观痕迹（图2BA，2个蓝色的痕迹和2个黑色的痕迹，分别）。灰色的痕迹，阴性对照组（“南德”）在其中的cDNA的qPCR反应。当从本实验的qPCR产品，通过提高他们的温度（即熔解曲线分析），它是明显的变性，适当的PCR产物（即是相同的，当浓度高得多的mRNA反转录和定量PCR扩增获得的扩增，数据未显示），目前只有以下RT，已为60分钟（图2BB，2个红色的痕迹）micromixed的反应。所有其他人（即micromixed5，trituration阴性对照）所产生的替代扩增产品（如引物二聚体）。
图1。申请的微观标准实验室RT反应的协议的流量图。涉及的物理原理，在微混合器，以及如何建立一个内部的微混合器提供更详细的描述中引用13,14
图2代表的qPCR数据显示的微观应用到前面的逆转录反应，包括在其他标准的实验室逆转录反应的单细胞的mRNA数量的好处 。一个比方的qPCR检测的cDNA代表Nurr - 1基因的mRNA编码的痕迹。前面的RT反应在25μL体积的总RNA中包含2.5pg，并在37℃，60分钟，在一个孵化器。逆转录反应混合的R triturationT组合前潜伏期（黑的痕迹，“trituration”），micromixed RT反应（蓝色的痕迹，“micromixed5”）在第5分钟，或为整个60分钟的RT反应micromixed的（红色的痕迹，“micromixed60” ）。平均值±中小企业的数量要求达到50％，最大荧光定量PCR周期曲线所示为n = 3的重复这个实验。星号表示显着性差异（单程与杜克多重比较方差分析）。 乙另一个qPCR的实验研究Nurr - 1基因的产品，这个时候包含在一个体积25μL25pg总RNA逆转录反应。 qPCR的痕迹（一）以及熔解曲线分析定量PCR获得的产品（B）所示为不同的搅拌条件下。还包括在没有基因包含在前面的RT反应的阴性对照（灰色的痕迹，“负”）。浓度高得多的mRNA RT反应也和生产micromixed60（二）（红色痕迹）样品相同熔解曲线峰（数据未显示）。
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Discussion
应用标准实验室RT反应的微观描述的方法可以，当然，涉及的mRNA通过任何方法（如细胞裂解，激光捕获显微切割）的收获。它也可以包括任何品牌或类型的RT试剂，任何温度（微混合器的材料的承受能力范围内），和任何时期。例如，我们已经看到了包括随机六聚体或寡DT引物的RT反应的cDNA产量提高。它也可能被应用到其他生化转换（例如DNA杂交15），符合以下限制。当前技术的主要制约因素是必须发生在一个小的（微升）解决方案的下降，形成一个弧形的液体空中接口（如半月板）的反应。我们经常使用卷10或25μL，200μL薄壁PCR管生产半月板分别为4.7或6.9毫米，曲率半径。这是一个在下降，从而拉长了不同的解决方案之间的接口设置一个旋涡流的要求，并允许扩散到地方在较短的时间尺度。这个约束，因此，适用于所有可能被用来在其中的微观情况。事实上，使用小卷可以是一个优势，因为往往是输入材料（如RNA，DNA）的数量是有限的，加上其他试剂可以大大节省。在特定背景下的RT反应产率提高，反应也必须包括一个mRNA的限制金额。我们已经表明的微观标准实验室RT反应，包括输入RNA的单细胞数量增加搅拌（摇晃，震荡或trituration），包括Nurr - 1说明以外的其他基因的标准方法，约10 - 100倍的cDNA产量这里14。我们还表明，这种改进降低输入RNA的浓度增加14。想必这是因为在较高的RNA浓度，增加扩散率的微观混合的情况下，确保更多的基因是转化为cDNA，它会降低之前。
微观混合的方法，将受益于高高保真通过反应釜反应液的声信号的传输。我们帮助实现小心混合覆亚克力板扬声器（图1），他们正是适合的200μL薄壁PCR管锥孔加工。这最大化之间的接触管和亚克力板，因此最大化的声信号的传输。人们也需要，以确保安全反应管内混合孔举行，因为他们可以在混合的机械振动。
我们声学microstreaming的定义是可能比一些现象学为基础的定义更广泛。然而，有一个良好莱利16的根本，而不是现象学，审查，分类这些流动。 Navier - Stokes方程的非线性项，已足够大，以便在第二为了有一个平均流量。由于这个词是一个速度倍速度梯度，我们做任何使速度变化足够小尺度（即足够大的速度梯度），可以带来一个microstreaming流。我们的声学microstreaming为基础的装置（“微混合器”）能够在音频频率（即低功耗），确保系统中有一个小半径曲率 13的液气界面声microstreaming。相比之下，“声流”往往是定义一个非线性项是由一个大的速度（即高功率）大。在我们的例子，在一个良好的小水滴是由振荡;连同其粘度，表面张力下降，可能会发挥创造了平均流量为混合 13的作用。实验还表明，大型（10 -100μm的）粒子可在 振动较大的下降比我们使用的移动，但是这可能是由不同的机制， 具体到粒子17。
总之，应用的微观标准实验室RT反应，包括单细胞的RNA金额大幅增加他们的cDNA产量的有效途径。这种改进及以上的混合微升卷使用目前可用的方法（即摇晃，震荡或trituration），可以实现。虽然有很多情况下，在微流体为基础的设备，执行RT将是一个巨大的进步，在其他情况下，包括我们自己的，单独的微观提供显着的和足够的利益，而不需要作进一步的专门设备和方法。
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Disclosures
作者们没有透露。
Acknowledgments
这项研究得到国家卫生和医学研究理事会澳大利亚（项目赠款。6288480）和Scobie和克莱尔麦金农信托。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
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