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嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Neuroscience

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Summary

ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージドcAMPまたはケージのCaの光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。

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Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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Abstract

ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物1の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ケージド化合物は紫外光のフラッシュと壊れる可能性の化学ケージで生理的に非アクティブに分子である。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージド化合物の光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。嗅覚情報伝達のプロセス(図1)の受容体に結合する嗅覚は、環状ヌクレオチド依存性(CNG)チャネル2を開くcAMPの増加につながる嗅神経細胞の繊毛で行われます。 CNGチャネルを通じて、CAエントリは、Ca活性化塩素チャネルを活性化する。我々は、マウス嗅上皮3、どのようにケージキャンプ4の光分解またはCa 5をケージでCNGチャネルまたはCa活性化塩素チャネルを活性化するから神経細胞を分離する方法を示しています</>のSup。我々は、パッチクランプ記録をホールセル電圧クランプの設定8-11の電流を測定するために取られている間、おりから出すのcAMPやCaに毛様体部分に紫外線が点滅を適用するにはフラッシュランプ6,7を使用してください。

Discussion

パッチクランプ記録と組み合わせケージド化合物のフラッシュの光分解は、生理活性分子の濃度の内側と外側の細胞の両方の急激かつ局所ジャンプを取得するために便利なテクニックです。ケージcompounds1のいくつかの種類が合成され、そしてこの技術は、アクティブまたは利用可能なケージド化合物11のいくつかの光分解によって変調することができるイオンチャネルを発現する培養細胞など、様々なタイプに適用することができます。

ケージド化合物の光分解は短時間での分子の十分な量を刑務所から出すために近紫外光の高強度のパルスを必要とします。連続運転水銀やキセノンアークランプシャッターで制御し、顕微鏡の落射蛍光ポート、キセノンフラッシュランプ、UVレーザに結合し、そして最近開発された高出力の紫外線発光ダイオード(LED:様々な光源を使用することができます。 )。光源の種類によって、それぞれ長所と短所を持っています特定のアプリケーションに、装置のコストに応じて利点とし。フラッシュランプと比較して、連続的に作動ランプが低い光強度を持っているため、シャッターで制御される光パルスの持続時間はuncaged分子の十分な量を得るためにミリ秒の数百にまで増加させる必要がある。 UVレーザーは、非常に高価です。フラッシュの光分解のためのハイパワーUV LEDは14が 、最近市販されており、他のメソッドへの良い代替手段を提供することができます。しかし、フラッシュランプの利点は、彼らが我々のアプリケーションでアンケージング用キセノンフラッシュランプを使用する主な利点は、異なるスペクトル特性を有するケージド化合物のいくつかのタイプの使用が可能、紫外LEDよりも広い発光スペクトルを有することである:よい時間分解能は、確かに光パルスの持続時間は約1ミリ秒です。異なる光化学特性を持つ分子の光分解に適している広範なUVスペクトル、ダイムを選択する可能性毛様体部分を照らすために光スポットのnsion、簡単に様々な光強度6を選択することが可能。さらに、キセノンフラッシュランプは、合理的なコストを持っている、それは簡単にセットアップ電気生理学的に実装されており、特別なメンテナンスを必要としません。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

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References

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