Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver ett protokoll för användning av benmorfogenetiskt protein-7 (BMP-7) eller Matrigel att selektivt inducera dendritisk tillväxt i primära sympatiska neuroner dissocierade från ganglion cervicale superius (SCG) hos perinatal råtta.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Formen på dendritiska bersån bestämmer den totala synaptiska mata in ett neuron kan ta emot 1-3, och påverkar de typer och fördelningen av dessa ingångar 4-6. Förändrade mönster av dendritiska tillväxt och plasticitet är förknippade med nedsatt neurodysfunktion funktion i experimentella modeller 7, och tros bidra till kliniska symptom som observerats i både nervsystemets sjukdomar 8-10 och neurodegenerativa sjukdomar 11-13. Sådana observationer understryker funktionella betydelsen av exakt reglering dendritiska morfologi, och tyder på att identifiera mekanismer som styr dendritiska tillväxten inte bara kommer att öka förståelsen för hur nervkopplingar regleras under normal utveckling, men kan också ge insikt om nya terapeutiska strategier för olika neurologiska sjukdomar.

Mekanistiska studier av dendritiska tillväxten skulle vara mycket underlättas av tillgången oFA modellsystem som gör att nervceller kan experimentellt kopplas från en stat där de inte sträcker sig dendriter till en där de utarbeta en dendritisk berså jämförbar med den av deras in vivo motsvarigheter. Primära kulturer av sympatiska neuroner dissocierade från ganglion cervicale superius (SCG) hos perinatal gnagare ger en sådan modell. Vid odling i definierat medium i frånvaro av serum och ganglion gliaceller, sympatiska neuroner sträcker sig ett enda förfarande, som är axonal, och detta unipolär tillstånd varar i veckor eller månader i odling 14,15. Emellertid utlöser tillsats av antingen benmorfogenetiskt protein-7 (BMP-7) 16,17-eller Matrigel 18 till odlingsmediet dessa neuroner sträcker sig till multipla processer som uppfyller de morfologiska, biokemiska och funktionella kriterier för dendriter. Sympatiska nervceller dissocierade från SCG av perinatala gnagare och odlas under definierade förhållanden är en homogen population av neuroner 19att reagera på samma sätt för den dendritliknande aktiviteten av Matrigel, BMP-7 och andra BMP i decapentaplegic (DPP) och 60A underfamiljer 17,18,20,21. Viktigare, inträffar Matrigel-och BMP-inducerade dendritbildning i frånvaro av förändringar i cellöverlevnad eller axonal tillväxt 17,18.

Här beskriver vi hur du ställer in dissocierade kulturer av sympatiska nervceller härrör från SCG av perinatala råttor så att de är lyhörda för den selektiva dendritliknande främja aktivitet Matrigel eller BMP.

Protocol

1. Beredning av odlingsmedium (C2 medium)

  1. Lägg till följande i angiven ordning, till en steril engångs 500 ml Erlenmeyerkolv:
    Mängd Komponent Slutkoncentration
    190 ml DMEM (låg glukos) N / A
    10 ml BSA utan fettsyror (20mg/ml i DMEM) 50 | ig / ml
    2,8 ml L-glutamin 1,4 mM
    4 ml insulin / transferrin / selen (100x) 10 | ig / ml insulin 5,5 | ig / ml transferrin 38,7 nM selen
    0,4 ml NGF (125 ng / ml) 100 ng / ml
    200 ml Ham F-12 N / A
  2. Virvla försiktigt to mix och alikvot 10 ml per rör i 17 x 100 sterila rör snäpplock.
  3. Lagra vid -80 ° C
  4. Viktig information:
    • Tina NGF omedelbart före användning.
    • Före alikvoter NGF stamlösning, förbeläggning de inre väggarna av den vävnadsodlingsplast serologisk pipett med protein för att minimera vidhäftning av NGF till plasten. Enklaste metoden är att Pipettera DMEM blandningen innehåller BSA flera gånger. Skölj NGF röret flera gånger med DMEM blandningen.
    • Lägg F-12 förra eftersom fri cystein kan destabilisera disulfidbindningar i insulin.
    • Får ej frysas i volymer större än 10 ml eftersom Capo 4 kristaller kan bildas
    • Får ej frysas-tina C2 mediet mer än 2 gånger.

2. Framställning av täckglas

  1. Vi har funnit att endast fina tyska täckglas arbetar konsekvent i detta protokoll (se tabell 1 för rekommenderade källa och katalognummer).
  2. Tillsätt 75-100 ml 70% salpetersyra och 300 prov ml glasflaskor med polytetrafluoretylen (PTFE eller Teflon) lock fodren (Fisher katalog nr 09-911-765).
  3. Handskar, täckglas droppe en efter en i salpetersyra. Tillsätt tillräckligt täckglas för att göra ett skikt inte mer än 2-3 täckglasen tjock på botten av burken.
  4. Skaka försiktigt behållarna med täckglasen för 6-8 timmar vid rumstemperatur på en orbital skakapparat inte mer än 185 rpm.
  5. Att arbeta i ett dragskåp, försiktigt Häll av syran och avyttra enligt lokala föreskrifter. Skölj täckglas gång med ultra-ren vävnadskultur-kvalitet vattnet, tillsätt sedan 75-100 ml vatten till behållaren. Täckglas kan sköljas flera gånger om vattnet blir grumligt. Skaka försiktigt vid rumstemperatur över natten på en orbital skakapparat för mer än 185 rpm.
  6. Upprepa ovanstående sekvens av salpetersyra / vävnadskultur-klassat vatten dagligen under totalt 3 dagar.
  7. Häll av sistavävnadskultur-grade vatten och tillsätt tillräckligt mycket aceton för att knappt täcka täckglas.
  8. Häll det aceton och kassera ordentligt.
  9. Överföra täckglas till en 150 mm petriskål av glas. Tillsätt tillräckligt aceton för att knappt täcka täckglas. Se täckglasen är i ett enda skikt i skålen.
  10. Tillåta aceton för att avdunsta över natten i ett dragskåp.
  11. Baka täckglas i en torkugn vid 180 ° C under 1,5 timmar för att sterilisera.

3. Beredning av Täckglas för kultur

  1. Dagen före dissektion, tillsätt 1 täckglas (framställd såsom beskrivits ovan) till varje brunn i en 24 brunnars vävnadsodlingsplatta med steril teknik. Tillsätt 200 pl sterilt poly-D-lysin (100 mg / ml i 0,5 M Tris-buffert, pH 8) till varje brunn och lagra plattan vid 4 ° C över natten.
  2. Dagen för dissektion och idealt innan dissektion, aspirera poly-D-lysin-lösningen från varje brunn och tvätta varje brunn 5 gångermed sterilt vävnads-kulturen kvalitet vatten.
  3. Tillsätt 200 pl låg-glukos DMEM till varje platta och lagra i 37 ° C inkubator. Cirka 1 timme före plätering celler, ta bort låg-glukos DMEM och tillsätt 250 pl C2 medium per brunn. Lagra plattor vid 37 ° C under 5% CO2 tills cellerna färdiga som skall pläteras.

4. Dissekering och isolering av Superior livmoderhalscancer Ganglion

  1. Dissocierade kulturer av sympatiska neuroner framställes vanligen genom dissociation av ganglion cervicale superius (SCG) skördades från prenatal (embryonala dagarna 19-21) råttungar eftersom det finns färre gliaceller. Emellertid kan detta samma protokoll användas framgångsrikt med tidiga postnatala (1 till 3 dagar gamla) råttungar eller perinatal ungar mus.
  2. Euthanize dräktig råtta via CO 2 inandning. Raka buken och tvätta huden med 70% etanol. Avlägsna livmoderhornen under sterila betingelser och placera livmoderhornen i en steril 150 mm petriskål. Undvikskada i tarmarna eller andra inre organ av dammen under dissektion.
  3. Placera petriskålen med valparna på en kastrull med is för att bedöva de embryonala valparna. Dissekera embryon som är fria från livmodern horn och amniotiska membran. Skär ryggmärgen på varje valp längs mittlinjen under axeln till euthanize valparna. Detta avskiljer också vena cava, vilket minskar blödning från karotidartären under dissekering av SCG. Gång dissekerades fri från livmoderhornet, placera embryona i en steril Leibovitz L-15-medium (eller någon luft-buffrat medium) kompletterat med penicillin och streptomycin.
  4. Placera embryon på ryggen på en 150 mm petriskål hälften fylld med Sylgard. Använda sterila 20 nålar, stift bröstkorgen och huvudet försiktigt hyperextending halsen, vilket underlättar dissektion av SCG.
  5. Göra en mittlinjesincision längs halsen vid nivån för de nyckelbenen att avslöja de submandibulära körtlar. Ta bort körtlar med fina pincett (no. 4 eller ingen. 5 Dumont) för att exponera muskelskiktet.
  6. Använd de fina pincett för att skära sternocleidomastoideus nära nyckelbenet. Sedan försiktigt lyfta och incisionsfilm den omohyoid muskeln intill luftstrupen. Denna muskel är mycket tunn, så undvik att skära för djupt för att undvika att riva den underliggande halspulsådern och SCG. När dessa muskler skikten avlägsnas, bör karotisartären och vagusnerven vara klart synliga.
  7. SCG ligger precis nedanför förgreningen av den karotiska artären. Användning fin pincett (nr. 4 eller ingen 5). Trubbiga dissekera vävnad från båda sidor av den karotiska artären för att exponera ganglion. Användning av 2 fin pincett, greppa den karotiska artären ovanför och nedanför den rostrala och kaudala änden av SCG, respektive, för att avlägsna den del av den karotiska artären som ligger ovanför SCG liksom SCG i sig. Det är troligt att KNUTIG ganglion, som ligger vid sidan av SCG i detta skede av utvecklingen, också kommer att tas bort i detta steg. Den KNUTIG ganglierna kan vara identified av dess runda form och det stora vagala nerven som skjuter ut från den. Detta ligger längs en av grenarna av halspulsådern. I motsats härtill är den SCG mandelformade och ligger direkt under bifurkationen av halspulsådern. Placera den dissekerade vävnaden i en steril 35 mm odlingsskål innehållande L-15 medium och antibiotika. Ta bort SCG från alla ungar innan du fortsätter till nästa steg.
  8. Med fin pincett försiktigt separera SCG från halspulsådern och andra bort vävnad under dissektionen (särskilt vagus nerven och KNUTIG ganglion). Använda fin pincett för att avlägsna kapseln från ganglierna. Detta minskar avsevärt antalet icke-neuronala celler i odling. Överföra ganglierna till en annan steril 35 mm skål innehållande L-15 medium.
  9. Att dissociera SCG, avlägsna L-15-medium och ersattes med 2 ml kollagenas (slutlig koncentration 1 mg / ml) / dispas (slutlig koncentration 5 mg / ml) i kalcium-och magnesiumfri Hanks balanserade saltlösning. InkubatorTE vid 37 ° C under 40 minuter.
  10. Överför SCG till en steril 15 ml koniskt centrifugrör och späd till 10 ml med L-15 kompletterat med BSA (slutlig koncentration 1-2 mg / ml). Centrifugera vid 200 x g vid rumstemperatur under 5 minuter. Kasta bort supernatanten och tvätta en gång med L-15 kompletterat med BSA.
  11. Efter den andra tvättningen avlägsna alla L-15 och återsuspendera ganglierna i ~ 2 ml C2-medium. Finfördela cellerna med hjälp av en brand-polerat böjd-tip pipett, se pipetten är belagd med BSA/L15 innan rivning för att minimera fastnar av celler till glaset. Finfördela försiktigt 3-4 gånger. Låt de stora klumparna sedimentera under ca 1 minut och överföra cellsuspensionen till en 15 ml koniskt rör. Lägg till fler C2 media till den återstående SCG och finfördela. Efter låta klumpar avveckla, överföra cellsuspensionen från den andra pulverisering som samlats efter den första rivning. Upprepa denna process flera gånger tills ganglierna är mestadels dissocierade. Discard kvarvarande klumpar efter den fjärde rivning.
  12. För celler dissocierade från en kull med råttungar (typiskt 12-16 valpar), att den totala volymen av mediet i cellsuspensionen till 8-10 ml genom att lägga till ytterligare C2 medium. Försiktigt återsuspendera cellerna med användning av en pipett och avlägsna en liten alikvot för bestämning av celldensitet. Justera volymen av cellsuspensionen för att uppnå 2x celltätheten önskas i kulturen och därefter, eftersom det är noga med att bibehålla cellerna i suspension, alikvot 250 ml cellsuspension per brunn. För morfometriska studier av dendritisk tillväxt, vi typiskt plattan celler vid låg densitet (~ 5 x 10 4-celler per brunn) i plattor med 24 brunnar.
  13. Vårt laboratorium ruvar SCG kulturer i glas exsickatorer snarare än direkt i en CO 2-inkubator. Vi gör detta på grund sympatiska neuroner odlade i serumfritt medium prestera bättre med en något högre CO-2 koncentration (ca 6,5%). Dessutom har vi inte använda antibiotika i Oåra media eftersom det hämmar neuritutväxt och underhåll av kulturer i exsickatorer verkar för att minimera spridningen av föroreningar om det utvecklas i en delmängd av kulturer. Med detta system upprätthåller vi rutinmässigt SCG kulturer i upp till 8 veckor. När pläterade och SCG kulturer placeras på porslin exsickatorn plattan i glas exsickatorer innehåller sterilt vatten i botten. Ca 120 ml CO 2 injiceras i exsickatorn före förslutning det stängda och att placera hela exsickator i en inkubator inställd på 35,5 ° C.

5. Utfodring och underhåll av kulturer

  1. Kulturer i allmänhet matas 3 gånger i veckan, med den första media utbytet sker 24 timmar efter plätering. Använd en steril böjd-tip pipett försiktigt tillbaka ungefär hälften av medierna per brunn. Med en ren steril böjd-tip pipett ersätta den volym av mediet bort med färsk C2.
  2. För att eliminera icke-neuronala celler från kulturen, anti-mitotiskt medel cytosine-D-arabinofuranosid (Ara-C, slutlig koncentration 1-2 pM) tillsätts vanligen till odlingsmediet vid den första utbyte av media (t.ex. 24 timmar efter utstrykning) under 48 timmar. Denna koncentration av Ara-C är vanligtvis tillräcklig för att avlägsna alla icke-neuronala celler. Om ytterligare ARA-C-behandling krävs, rekommenderas att dessa görs vartannat utfodring för att minimera toxiska effekter på nervceller.

6. Induktion Dendritic Tillväxt med Matrigel eller BMP-7

  1. Att inducera dendritisk tillväxt, är Matrigel eller BMP-7 tillsattes till kulturer efter icke-neuronala celler har eliminerats och ARA-C-nivåer i kulturerna reduceras avsevärt. Typiskt adderar vi Matrigel eller BMP-7 till mediet på dag 5 in vitro, men dendritisk tillväxt kan induceras genom Matrigel eller BMP-7 tillsättas vid vilken tidpunkt in vitro. Matrigel eller BMP-7 sättes till C2-medium och kulturerna matas såsom beskrivits ovan.
  2. Matrigel och BMP-inducerade dendritisk tillväxt är tidenoch koncentrationsberoende. För maximala effekter är Matrigel sattes till C2 vid en slutlig koncentration av 50-75 pg / ml; BMP-7 sättes till C2-medium vid en slutkoncentration av 50 ng / ml. Matrigel koncentrationer större än 100 | ig / ml eller BMP-7 koncentrationer större än 100 ng / ml har noterats att orsaka neuronal toxicitet. Dendritiska processer (såsom bestämts genom morfologiska kriterier) att bli uppenbara ca 48 timmar efter initial exponering för Matrigel eller BMP-7 vid maximalt effektiva koncentrationer. För att inducera robust dendritisk tillväxt, kulturerna matas med BMP-7 medium vid varje utfodring. Ekvivalenta resultat har erhållits med användning av BMP 2, 4, 5 och 6 vid jämförbara koncentrationer 20,21.

7. Immunocytokemisk analys av BMP-7-inducerad dendritisk tillväxt

  1. När den önskade graden av dendritisk förgrening har uppnåtts, är fixerades kulturerna med användning av 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert. Den bästa fixering är enchieved genom att ersätta hälften av mediet i brunnen med 4% paraformaldehyd och att upprepa detta steg 3-5 gånger under 10-15 minuter.
  2. Skölj kulturer genom att ersätta hälften av 4% paraformaldehyd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och upprepning av detta steg tre gånger över 10 - 15 minuter.
  3. Avlägsna all PBS och tillsätt 200 | il 0,1% Triton X-100 i PBS till varje brunn under 5 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera cellerna.
  4. Avlägsna Triton-lösning genom aspiration och tillsätt 200 | il per brunn av blockeringsbuffert (PBS kompletterat med 3-5% BSA och 1% getserum). Inkubera i 20-30 minuter vid rumstemperatur.
  5. Avlägsna den blockerande bufferten och lägga till den primära antikroppen, mikrotubulus-associerat protein-2 (MAP2) utspädd 1:2000 i - 1:5000 i blockerande buffert. Inkubera kulturer för 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
  6. Avlägsna den primära antikroppen och tvätta kulturerna med PBS tre gånger under 15 minuter vid rumstemperatur.
  7. Inkubera kulturer med sekundär antikropp utspädd i PBS supplementerat med 1% BSA under 1-2 timmar vid rumstemperatur i mörker.
  8. Avlägsna den sekundära antikroppen och tvätta kulturerna med PBS tre gånger över 10-15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  9. Monteringspunkter täckglas på objektglas cellen nedåt i en droppe vattenhaltig monteringsmedium vid lämpligt pH för den fluorokrom märkta till den sekundära antikroppen. Håll glasen vid rumstemperatur över natten för att låta monteringsmedium torr. Lagra bilder vid 4 ° C tills avbildning.
  10. Låt objektglasen jämvikt till rumstemperatur innan du avbildning. Skaffa fluorescerande bilder med ett faskontrastmikroskop utrustad för epifluorescens. Typiskt kan hela dendritiska dornen hos en enda neuron fångas med hjälp av en 20x objektiv och lämpliga filter.

8. Representativa resultat

Sympatiska nervceller dissocierade från SCG för perinatal RAts och odlades i frånvaro av serum och ganglion gliaceller misslyckas att förlänga MAP2 immunopositiva processer (figur 1), utan snarare, typiskt sträcka sig endast en enda axonal process 14,15. Exponering för BMP-7 (figur 1) eller Matrigel inducerar bildandet av många processer som uppfyller de morfologiska, biokemiska och funktionella kriterier av dendriter 17,18. Den dendritliknande aktiviteten av antingen Matrigel eller BMP-7 är koncentrationsberoende och tidsberoende 17,18,20. Maximal dendritisk tillväxt observeras med användning av koncentrationer av Matrigel mellan 50 och 75 | ig / ml eller BMP-7 mellan 30 och 100 ng / ml, och halv-maximal effekt typiskt observeras vid BMP-7 koncentrationer av ~ 2 ng / ml. Emellertid kan betydande ändringar i dendritisk tillväxt detekteras med BMP-7 koncentrationer så låga som 300 pg / ml. Den dendritiska svar på antingen Matrigel eller BMP-7 är relativt långsam, med <50% av neuronerna som bildar en andra process inom 24 timmar efter exponering för antingen dendrit-p RÄMJA medlet. Men inom 3 dagar efter den första BMP-7 exponering nästan alla neuroner svara på maximalt effektiva Matrigel eller BMP-7 koncentrationer. Antalet dendriter per nervceller fortsätter att öka med kontinuerlig exponering för BMP-7, med de flesta av förändringen inträffar under de första 10 dagarna av behandlingen. Efter 4 veckor, BMP-7-behandlade neuronerna har typiskt 6-8 primära dendriter som uppvisar sekundära, tertiära och kvartära även dendritiska grenar 17. Denna ökning av dendritiska berså sker i avsaknad av betydande förändring axonal tillväxt, och jämförbara dendritiska kan framkallas genom att använda liknande koncentrationer av BMP 2, 4, 5 eller 6 20,21. Dendritisk tillväxt kan även framkallas genom samtidig odling av sympatiska neuroner med endogena ganglie gliaceller 15,22, men det är den dendritiska svaret signifikant långsammare under dessa betingelser.

. Jpg "/>
Figur 1. BMP-7 främjar dendritisk tillväxt i odlade sympatiska neuroner. Icke-neuronala celler har tagits bort från SCG kulturer genom behandling med anti-mitotiska under 48 timmar med början dag 2 in vitro. Med början på dag 5 in vitro behandlades kulturer med antingen kontrollmedium (A) eller medium kompletterat med BMP-7 vid 50 ng / ml (B). På dag 11 in vitro (efter 5 dagars BMP behandling) var odlingar immunfärgades med mAb mot MAP2 fann ett protein främst i dendriter och neuronal somata. Såsom visas i de representativa mikrofotografier fluorescens, neuroner odlade under kontrollbetingelser saknar dendriter såsom bevisas av avsaknaden av MAP-2 immunopositiva processer dendriter (A), i kontrast, neuroner exponerades för BMP-7 (B) har typiskt ett flertal avsmalnande MAP-2 immunopositiva dendriter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fördelarna med denna modell innefattar: (a) kulturerna består av en homogen population av sympatiska neuroner som saknar andra celltyper 17,23, (b) de tillväxtfaktorreceptorer krav sympatiska neuroner är väl etablerad, vilket medger användning av definierat medium, och en mängd olika definierade medier och substrat fungerar bra för att odla och upprätthålla sympatiska neuroner 23, (c) neuroner i dessa kulturer reagera på samma sätt för den dendritliknande aktiviteten av Matrigel, BMP-7 och andra BMP av DPP och 60A subfamiljer 17,18,20,21, och (d) Matrigel-eller BMP-inducerade dendritbildning sker i frånvaro av förändringar i cellöverlevnad eller axonal tillväxt 17,18. Denna modell möjliggör experimentell kontroll över när dendritisk tillväxt utlöses, vilket gör det möjligt att erhålla synkroniserade populationer av neuroner vid olika stadier av dendritisk tillväxt, t ex omedelbart före bildningen av dendriter, under primär dendritogenesis (den initiala bildningen av primära dendriter) och under senare stadier av dendritiska mognad. De mest signifikanta begränsningar hos modellen inkluderar de begränsade mängderna av RNA och protein kan erhållas från en typisk dissektion av en enda kull, vilket kan begränsa biokemiska studier, och någon svårighet i att manipulera gen-expression. Nyligen gjorda framsteg i tekniken för att uttrycka cDNA i primära neuronala cellkulturer snabbt övervinna denna senare nackdel. Det finns publikationer som rapporterar den framgångsrika tillämpningen av lipidbaserade avgivningssystem nucleofection och adenovirala vektorer till odlade sympatiska neuroner. De rapporterade transfektionseffektiviteter är relativt låg (typiskt sträcker sig från 10-20% med lipofektion eller nucleofection och upp till 30-50% med viral infektion), som är tillräcklig för slutpunkter baseras på individuella celler analyser, såsom morfologiska analyser, men kan vara problematiskt för många biokemiska endpoints.

Faktorer that kan interferera med BMP-inducerade dendritisk tillväxt i odlade sympatiska neuroner innefattar odling av neuroner vid en mycket hög celldensitet och med serum i odlingsmediet. Medan den anledningen att hög celltäthet dämpar den dendritliknande aktiviteten av BMP är inte känd, är det troligt att serum dämpar denna aktivitet därför BMP binda ivrigt till serumproteiner. Intressant nog har serum sig svaga dendritliknande främja aktiviteten i odlade sympatiska nervceller 24, och våra preliminära data tyder på att denna aktivitet förmedlas av BMP, som är närvarande i de flesta om inte alla kommersiella sera. BMP är också närvarande i Matrigel och sannolikt förmedla dess dendritliknande aktivitet. En tredje faktor som kan påverka den dendritliknande aktiviteten av BMP är felaktig hantering och lagring av BMP. Lagrar inte BMP stamlösningar med en koncentration av mindre än 0,1 mg / ml. Det är viktigt att inte låta BMP lager eller fungerande lösningar att bli mycket grundläggande och vi rekommenderar att BUFföringar som används för utspädning av förrådslösningar ha ett pH av 4,5 ± 0,05. Blanda alla lösningar kraftigt före alikvotering men inte så kraftigt att lösningar skum och bara använda polypropenrör eftersom BMP har en tendens att hålla sig till andra plaster. Förvara inte alikvoter i frysar som har en automatisk avfrostning funktion eftersom omsättningen av temperaturer är tillräcklig för att förstöra aktiviteten av BMP-7. Det rekommenderas starkt att BMP lösningar lagras vid -80 ° C och att frysning-upptining minimeras (vi inte frysning-tining mer än 2-3 gånger). Liknande försiktighetsåtgärder bör användas vid hantering Matrigel. Dessutom rekommenderas att Matrigel långsamt tinas vid 4 ° C. Matrigel kommer inte inducera dendritisk tillväxt när de används för att förbelagda substrat före plätering neuroner, utan det är endast effektiva när de tillsätts till odlingsmediet av etablerade neuronala cellkulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (bidrag R21 NS45037 och R01 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics