Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Biology

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Summary

13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

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You, L., Page, L., Feng, X., Berla, B., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids. J. Vis. Exp. (59), e3583, doi:10.3791/3583 (2012).

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Abstract

Micróbios têm complexo de vias metabólicas que podem ser investigados usando métodos de bioquímica e funcional genômica. Uma técnica importante examinar o metabolismo celular central e descobrir novas enzimas é de 13 C-assistida análise metabolismo 1. Esta técnica é baseada na rotulagem isotópica, em que os micróbios são alimentados com um 13 substratos C rotulados. Ao traçar os caminhos átomo de transição entre metabólitos na rede bioquímicos, podemos determinar caminhos funcional e descobrir novas enzimas.

Como um método complementar para transcriptômica e proteômica, abordagens para isotopomer assistida análise de vias metabólicas conter três etapas principais 2. Primeiro, cultivar células com 13 substratos C rotulados. Nesta etapa, a composição do meio e da seleção de substratos marcados são dois fatores-chave. Para evitar ruídos de medição a partir de carbono não-rotulados de suplementos nutricionais, Um meio mínimo com uma única fonte de carbono é necessária. Além disso, a escolha de um substrato marcado é baseada em como efetivamente ele irá elucidar o caminho a ser analisada. Porque muitas vezes envolvem enzimas romance estereoquímica reação diferente ou produtos intermediários, em geral, substratos de carbono individualmente rotulados são mais informativos para a detecção de caminhos novos do que os uniformemente marcado para a detecção de vias novela 3, 4. Em segundo lugar, analisar os padrões de rotulagem de aminoácidos usando GC -MS. Aminoácidos são abundantes em proteínas e, portanto, pode ser obtido a partir da hidrólise da biomassa. Aminoácidos pode ser derivatizado por N-(terc-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) antes da separação GC. TBDMS derivatizado aminoácidos pode ser fragmentado por MS e resultam em diferentes matrizes de fragmentos. Com base na massa à relação de carga (m / z) de fragmentação e não fragmentado aminoácidos, podemos deduzir os padrões possíveis rotulados dos metabólitos que são centraisprecursores dos aminoácidos. Terceiro, traçamos transições de carbono 13C nas vias propostas e, com base nos dados isotopomer, confirmar se estes caminhos são dois ativos. Medição de aminoácidos fornece informações de rotulagem isotópica cerca de oito metabólitos precursor crucial no metabolismo central. Esses nós metabólicos chave podem refletir as funções de associados vias centrais.

13 A análise do metabolismo C-assistida via proteinogénicos aminoácidos pode ser amplamente utilizado para a caracterização funcional de mal-caracterizada metabolismo microbiano 1. Neste protocolo, usaremos Cyanothece 51142 como cepa modelo para demonstrar o uso de substratos de carbono marcado para descobrir novas funções enzimáticas.

Protocol

1. Cultura de células (Figura 1)

  1. Cultivar células em meio mínimo com oligoelementos, sais, vitaminas e substratos de carbono especificamente rotulados que são melhores para a investigação caminho. Usar qualquer agitação ou biorreatores frascos para cultura de células. Nutrientes orgânicos, tais como extrato de levedura, pode interferir com a medição de rotulagem de aminoácidos e, portanto, não pode estar presente no meio de cultura.
  2. Monitorar o crescimento de células pela densidade óptica da cultura em um comprimento de onda ideal (por exemplo, OD 730 para Cyanothece 51142), com um espectrofotômetro UV / Vis.
  3. As células podem ser cultivadas primeiro em um meio não marcado. O meio-log células fase de crescimento são preferidos a serem utilizados para a inoculação (3% (v / v) por razão de inoculação volume) do meio rotulados. A cultura deve ser rotulado sub-cultura (3% v / v relação de inoculação) no mesmo meio rotulado para evitar a introdução de carbono não-marcado a partir do inóculo inicial.
  1. Colheita sub-cultura de células (10 ml) em fase de crescimento médio log-por centrifugação (10 min, 8000 × g).
  2. Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de HCl 6M e transferi-lo para um vidro transparente, com tampa frasco GC. Cap os frascos e coloque-os em forno a 100 ° C por 24 horas para hidrolisar as proteínas da biomassa em aminoácidos. Hidrólise de pellets de biomassa pode produzir 16 dos 20 aminoácidos comuns (Figura 2) 5. Cisteína e triptofano são degradadas, e glutamina e asparagina são convertidos para o glutamato e aspartato, respectivamente.
  3. Centrifugar a solução de aminoácidos a 20.000 × g por 5 min em tubos de 2 ml Eppendorf, e transferir o sobrenadante para novos frascos GC. Essa etapa remove partículas sólidas na solução de hidrólise.
  4. Remover as tampas frasco GC e secar as amostras completamente sob um fluxo de ar através de uma reativação Thermo Scientific-Vap evaporador (nota: um secador de congelamento também pode ser usado tamostras o seco). Esta etapa pode ser feito durante a noite.

3. Derivatização de aminoácidos e GC-MS condições

Análise de aminoácidos ou carregadas / altamente metabolitos polares via GC exige que estes metabólitos ser derivatizado, de modo que os aminoácidos são voláteis e podem ser separados por cromatografia em fase gasosa 2.

  1. Dissolver as amostras secas com 150 mL de tetrahidrofurano (THF) e 150 mL de N-(terc-butyldimethylsilyl) reagente de derivatização-N-methyltrifluoroacetamide.
  2. Incubar todas as amostras em um forno ou em banho-maria entre 65 e 80 ° C por 1 hora. Vortex, ocasionalmente, para se certificar de que os metabolitos no frasco são dissolvidos.
  3. Centrifugar as amostras a 20.000 × g por 10 min, e depois transferir o sobrenadante para novos frascos GC. O sobrenadante deve ser uma solução clara e amarelada. Devido à saturação dos detectores, GC-MS precisão da medição pode ser afetada pela alta concentration de injeção TBDMS derivatizado aminoácidos (estas amostras freqüentemente mostra cor marrom escuro), portanto, devemos diluir essas amostras utilizando THF antes de GC-MS medição 6.
  4. Análise das amostras por GC-MS (use um 1:05 ou 1:10 dividir relação de volume de injeção, = 1 mL de transporte de gás hélio = 1,2 mL / min). Use o programa de temperatura seguintes GC: mantenha a 150 ° C por 2 minutos, aumento de 3 ° C por min a 280 ° C, aumento de 20 ° C por minuto até 300 ° C e mantenha por 5 minutos. Atraso solvente pode ser definido como ~ 5 minutos (para uma coluna GC 30 metros). O alcance da massa e carga ratio (m / z) em MS pode ser definida entre 60 e 500.

4. GC-MS de análise de dados

  1. TBDMS medição de ácido amino derivatizado também podem ser afetados pela discriminação dos isótopos na separação GC. Isótopos luz mover-se ligeiramente mais rápido do que heave isótopos na coluna GC. Para reduzir o viés de aferição potencial, podemos média do espectro de massa do conjuntogama de pico amino ácido 6
  2. A GC e MS espectros de metabólitos TBDMS derivatizado foram relatados antes de 7. O tempo de retenção ea única GC m / z picos para cada aminoácido são ilustrados na Figura 3.
  3. Derivatização de aminoácidos ou metabólitos centrais apresenta quantidades significativas de isótopos naturalmente marcado, incluindo 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%), e 30 Si (3,09%). O ruído de medição de isótopos naturais no espectro de massa crua isotopomer pode ser corrigido usando software publicou 5, 8. A final de dados isotópicos rotulagem são relatadas como frações de massa, por exemplo, M 0, M 1, M 2, M 3 e M 4 (representando fragmentos contendo zero a quatro carbonos marcados 13 C).
  4. Medição de aminoácidos pode fornecer informações de rotulagem isotópica cerca de oito metabólitos precursor crucial: 2-oxo-glutarcomeu, 3-P-glicerato, acetil-CoA, eritrose-4-P, oxaloacetato, fosfoenolpiruvato, piruvato e ribose-5-P. Os padrões de rotulagem desses metabólitos podem ser usados ​​para identificar várias vias metabólicas central (Figura 2) 9. O resultado dos experimentos rotulagem pode ser confirmado através de métodos bioquímicos outros (por exemplo, RT-PCR).

5. Análise de caminho usando rotulados de dados de aminoácidos

Ao investigar apenas alguns aminoácidos-chave produzido a partir de 13 bem concebidos experimentos C traçador, que pode revelar várias vias originais ou atividades enzimáticas sem executar sofisticadas análises de fluxo 13 C-metabólicas do metabolismo central de todo.

  1. Entner-Doudoroff caminho: [1 - 13 C] glicose pode ser usado como fonte de carbono. Se o caminho está ativo, rotulagem serina será significativamente menor do que a rotulagem da alanina 10.
  2. Ciclo TCA ramificada: [1 - 13 C]piruvato pode ser usado como fonte de carbono. Se o ciclo TCA é quebrado, aspartato pode ser rotulado por dois átomos de carbono, enquanto o glutamato é rotulado com apenas um carbono 11, 12.
  3. CO 2 por fixação de Calvin-Benson-Bassham ciclo em um metabolismo mixotróficas: Non-rotulados CO 2 e rotuladas substratos de carbono são usados ​​como fontes de carbono. Se o ciclo de Calvin é funcional, serina e histidina rotulagem será significativamente diluída, em comparação com outros aminoácidos. Tal método pode determinar a relação CO 2 quando as fontes de fixação de carbono orgânico está presente nos 13 médio.
  4. Via fosfato pentose oxidativo: [1 - 13 C] glicose pode ser usado como fonte de carbono. Se o caminho está ativo, a alanina não marcado será> 50% 12.
  5. Pathway Anaplerotic (por exemplo, PEP + CO 2 à oxaloacetato): 13 CO 2 e não-rotulados de carbono substratos (eg glicerol, ou pyruvate) pode ser usado como fonte de carbono. Se o caminho está ativo, rotulagem aspartato será significativamente enriquecido, em comparação com alanina e serina 13.
  6. Re citrato-sintase: [1 - 13 C] piruvato pode ser usado como fonte de carbono. Se a enzima é ativa, o glutamato é rotulado de β-carboxi grupo 3, 4.
  7. Pathway Citramalate: [1 - 13 C] piruvato, [2 - 13 C] glicerol, ou [1-13 C] acetato pode ser usado como fonte de carbono. Se o caminho está ativo, quantidades rotulagem leucina e isoleucina são idênticos 14.
  8. Serina-isocitrato liase ciclo: [1 - 13 C] piruvato ou [1-13 C] lactato pode ser utilizado como fonte de carbono. Se o caminho está ativo, o carbono terceira posição em serina será marcado 15.
  9. Utilização dos nutrientes (ou seja, aminoácidos exógenos): um meio de cultura com substratos de carbono totalmente rotulados e não rotulados aminoácidospode ser usado. Se as células seletivamente utilizar esses nutrientes suplementada não marcado, vamos ver diluição significativa rotulagem destes aminoácidos na biomassa. Este método pode ser usado para investigar quais suplementos nutricionais são os preferidos pela célula 16.

6. Resultados representante

Estudos de bioenergia recentes têm reavivado interesse em usar microorganismos fototróficas novela para a produção de bioenergia e de captura de CO 2. Nos últimos anos, muito poucos 13C metabolismo-análises, incluindo análises avançadas 13C-Metabolic Flux (MFA-13C), têm sido aplicados para investigar o metabolismo central em bactérias fototróficas, porque o conhecimento bioquímicos das vias metabólicas centrais não é bem fundamentada nestes organismos não-modelo de 10, 11, 17-20. Aqui, apresentamos um exemplo da descoberta de um caminho alternativo no isoleucina Cyanothece 51.142 21. Cyanothece 51.142 não contém a enzima (CE 4.3.1.19, treonina amônia-liase), que catalisa a conversão de treonina a 2 cetobutirato-no caminho típico isoleucina síntese. Para resolver o caminho isoleucina, nós crescemos Cyanothece 51.142 (20 mL) em meio ASP2 22 com 54 mM de glicerol (2-13C,%> 98). Cyanothece 51142 utiliza 2 ª posição glicerol rotulados como fonte de carbono principal. Observamos que treonina e alanina tem um escrito de carbono, enquanto isoleucina é rotulado com três carbonos. Portanto, a síntese em Cyanothece 51142 não pode ser derivada a partir da rota de treonina utilizados pela maioria dos organismos (Figura 4). Por outro lado, leucina e isoleucina têm padrões de rotulagem idênticos com base no fragmento (M-15) + e fragmento (M-159) +. Por exemplo, os dados isotopomer a partir de [M-15] + (contendo unfragmented aminoácidos) mostrou marcação idêntica para leucina (M0 = 0,01, M1 = 0.03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) e isoleucina (M0 = 0,01, M1 = 0.03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Assim, leucina e isoleucina deve ser sintetizada a partir de precursores mesma (ou seja, piruvato e acetil-CoA). Esta observação é consistente com a transição de carbono marcado na via citramalate para a síntese de isoleucina. Para confirmar esta via, que busca a Joint Genome Institute banco de dados e encontrar a presença de um sintase citramalate Cima (cce_0248) em Cyanothece.

Figura 1
Figura 1. O 13 C-assisted etapas da análise caminho.

Figura 2
Figura 2. Aminoácidos usado para adquirir o padrão de marcação de seus precursores metabólicos. ACOA, acetil-CoA; AKG, α-cetoglutarato; C5P, ribose 5-fosfato; CIT, citrato; E4P, eritrose 4-fosfato; G6P, glicose 6-fosfato; OAA, oxaloacetato; fosfoenolpiruvato PEP,; PGA, 3-fosfoglicerato, PYR, piruvato.

Figura 3
Figura 3. Picos GC por 16 aminoácidos. TBDMS derivatizado aminoácidos são rachados por MS em dois fragmentos: (M-57) +, contendo o ácido amino inteira, e (M-159) +, o que não tem o grupo α carboxila do aminoácido. Para leucina e isoleucina, a + (M-57) foi sobreposta por picos de massa outros. Sugerimos o uso de fragmento (M-15) + para analisar a rotulagem de ácido amino inteira. O (F302) + grupo é detectada na maioria dos aminoácidos, que contém apenas o primeiro (grupo α-carboxila) e carbonos segundo em um backbone de aminoácidos. Porque esse pico MS muitas vezes tem alto nível de ruído ao sinal-razões, (F302) + não é recomendado para quantitativamente análise dos fluxos metabólicos 7.

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Figura 4. Labeling transições em vias de isoleucina na Cyanothece 51.142 (modificado de nosso artigo anterior) 21.

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Discussion

Este protocolo consiste em alimentar a célula com um substrato rotulados e medir o resultado padrões de rotulagem isotópica na aminoácidos através de GC-MS. Desde MS de dados (m / z rácios) dar apenas o montante global da rotulagem de íons de MS, temos que avaliar as distribuições isotopomer de aminoácidos, examinando as razões m / z de ambos não fragmentado (M-57) + e fragmentado aminoácidos (ie, (M-159) + e (F302) +). Além disso, podemos realizar várias culturas de células com um meio quimicamente idênticas, mas substratos que têm padrões de rotulagem diferentes (1 ª posição rotulada, 2 ª posição rotulada, etc.) As informações sobre rotulagem metabólitos desses experimentos podem ser integrados para decodificar as rotas de transição real de carbono através das vias metabólicas central.

Para a análise de caminho, a escolha de um substrato marcado é importante. Em geral, os substratos de carbono isoladamente são rotulados easier para usar em traçar o destino do carbono marcado quando 13 se infiltra C através de vias centrais, enquanto múltiplas carbono-rotulados substratos podem confundir carbono rastreamento. Além disso, substratos isoladamente rotulados são mais informativos para elucidar estruturas molécula única a metabólitos de substratos uniformemente marcado. 4 Por exemplo, o citrato sintase (Re)-tipo mostra estereoquímica reação diferente da citrato sintase normal, e assim faz com que o citrato de ter quiralidade molecular diferentes . Por outro lado, os substratos são diferentes em sua adequação para detectar suas vias associadas. Glicose é melhor para detectar a razão de separação entre a glicólise e vias de fosfato pentose, enquanto o piruvato ou acetato são melhores para analisar o ciclo de TCA e alguns caminhos de aminoácidos. Portanto, é necessário o uso de diferentes substratos para investigar o panorama geral do metabolismo celular.

13 C-isótoporotulagem é uma técnica útil para determinar as vias funcionais em microorganismos. No entanto, esta técnica tem várias limitações. Primeiro, ele é adequado apenas para a análise do metabolismo de carbono utilizando substratos orgânicos, como ele não pode resolver o metabolismo no metabolismo autotrófico se CO 2 é usado como a única fonte de carbono. Culturas autotrófico usando CO 2 rótulo todos os aminoácidos, na mesma medida que os 12 CO de entrada 13/02 mistura de CO 2 23. Isso faz com que análise de caminho difícil, como a análise de metabolismo tem de ser inferida a partir de um rearranjo de 13 carbonos C em metabólitos por diferentes vias metabólicas. Em segundo lugar, este trabalho apresenta resultados apenas qualitativos discriminar entre "ativa" e "não ativa" caminhos. Quantificação precisa do metabolismo requer uma abordagem de modelagem sofisticada (ie, Terceiro, o escopo da análise de 13 C-metabolismo é limitado por desafios técnicos na determinação de baixa abundância e metabólitos instável. Rede mais ampla metabólica pode ser sondado por analisar metabolitos livres além de aminoácidos. Mensuração de metabólitos livres requer tanto altamente eficientes métodos de extração de metabólitos e altamente sensível plataformas analíticas. LC-MS, FT-ICR MS e CE-MS têm sido usados ​​para identificar os padrões de rotulagem de metabólitos livres, e fornecer mais detalhes sobre o metabolismo das células 2. Quarta, 13 de análise de caminho C-assistida é o melhor feito em meio mínimo, porque Além de não rotulados suplementos nutricionais leva a concentrações rotulagem falsamente mais baixos e tornar quantitativas 13 C-MFA estudos não tão simples. Além disso, as células podem utilizar aminoácidos exógenos extensivamente para a proteína sintetizandos, e assim dar sinais de rotulagem muito fraco para estes ácidos aminados proteinogénicos 24. Se um meio rico é necessário para cultivar células, medição de metabólitos intracelulares, em vez de aminoácidos, pode efetivamente reduzir a interferência na rotulagem de dados que resulta de nutrientes exógenos não-rotulados de carbono.

Finalmente, um número crescente de seqüências do genoma de espécies não-modelo microbiana estão sendo publicados a cada ano. No entanto, a caracterização funcional dessas espécies tem ficado muito atrás do ritmo de sequenciamento genômico. 13 C-rotulagem abordagens podem desempenhar papéis importantes na confirmação e na descoberta de vias metabólicas em muitos organismos não-modelo. Além disso, as informações de rotulagem podem ser integrados com modelagem metabólica (13 C-MFA) para fluxos de carbono decifrar absoluta em microorganismos 25. Portanto, essa técnica pode ser amplamente utilizado na análise de sistemas biológicos relacionados com a de biocombustíveis, Ecologaplicações iCal e médicos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado por uma carreira NSF Grant (MCB0954016) e um Bioenergia DOE Research Grant (DEFG0208ER64694).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TBDMS Sigma-Aldrich 19915 -
THF Sigma-Aldrich 34865 -
Labeled carbon substrate Cambridge Isotope Laboratories Depend on the experimental requirement Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph Agilent Technologies Hewlett-Packard, model 7890A -
GC Columns J&W Scientific DB5 (30m) -
Mass spectrometer Agilent Technologies 5975C -
Reacti-Vap Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. TS-18825 For drying amino acid samples

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References

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