Ex vivo organotypisk hornhinnan modell av akut epitelial herpes simplex virus typ I-infektion

Published 11/03/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denna video artikeln beskriver vi användningen av en ny

Cite this Article

Copy Citation

Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. J. Vis. Exp. (69), e3631, doi:10.3791/3631 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Herpes keratit är ett av de mest allvarliga patologier associerade med herpes simplex-virus-typ 1 (HSV-1). Herpes keratit är idag den ledande orsaken till både hornhinnan härrörande och infektion-associerad blindhet i den utvecklade världen. Typiska presentation av herpes keratit inbegriper infektion av hornhinnans epitel och ibland djupare hornhinnestroma och endotel, vilket leder till sådana permanenta hornhinnan patologier som ärrbildning, gallring, och opacitet 1.

Korneal HSV-1-infektion traditionellt studerats i två typer av experimentella modeller. In vitro-modell, där odlade monoskikt av hornhinneepitelceller infekteras i en petriskål, erbjuder enkelhet, hög reproduktionsförmåga snabba experiment och relativt låga kostnader. Å andra sidan, erbjuder in vivo-modell, där djur såsom kaniner eller möss ympas direkt i hornhinnan, en mycket sofistikerad fysiologisksystemet, men har högre kostnader, längre experiment, nödvändig djuromsorg och en högre grad av variabilitet.

I denna video artikeln, tillhandahåller vi en detaljerad demonstration av en ny ex vivo modell av korneaepitelet HSV-1-infektion, vilken kombinerar styrkan i både in vitro-och in vivo-modeller. Ex vivo-modellen använder intakta hornhinnor organotypically upprätthålls i kultur och infekterade med HSV-1. Användningen av ex vivo-modellen möjliggör höggradigt fysiologiskt baserade slutsatser, men det är ganska billig och kräver tid engagemang jämförbar med den in vitro-modell.

Protocol

Alla reagens och utrustning köptes sterila eller steriliserades före förfarandet. I den här artikeln beskrivs steg för att starta den ex vivo-modellen börjar med en pre-utan kärna öga. I våra experiment använder vi färska hela ögonglober från unga (8-12 veckor) albinokaniner (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Dessutom använder vi människor hornhinnor som erhållits från den lokala ögonbank. Om du utför enucleation själv noga med att undvika skador på hornhinnan eller limbus under förfarandet. Kanin enucleation protokoll kan hittas någon annanstans 2.

Del 1: excision av Corneoscleral knappen

  1. Blöt en smal remsa av gasväv med PBS och linda den runt ögongloben för att underlätta att hålla det under förfarandet.
  2. Använd en vass skalpell för att göra en tangentiell snitt i sklera, cirka 0,5 cm avstånd från limbus.
  3. Använd vass sax att förlänga snittet och helt punktskatt corneoscleral knapp.
  4. När corneoscleral knappen isolerad, retas bort iris medan du håller skleral kanten med pincett. Undvik att skada endotelet eller utöva överdriven stress på hornhinnan.

Del 2: Införande av hornhinna till organotypisk kultur

  1. Explanterade hornhinnor odlas i Minimum Essential Medium (MEM) kompletterat med icke-essentiella aminosyror (1X), L-glutamin (2 mM), penicillin (200 U / ml), och streptomycin (200 pg / ml). Ett antisvampmedel, såsom amfotericin, kan också tillsättas om så är nödvändigt.
  2. Bered en 1% agaros-lösning i odlingsmedium och hålla den redo vid 55 ° C.
  3. Skölj hornhinnan i steril PBS innehållande penicillin (200 U / ml) och streptomycin (200 pg / ml).
  4. Placera hornhinnan epiteliala nedåt i en brunn av en steril provplatta.
  5. Tillsätt agaros-innehållande medium till den endoteliala konkavitet hornhinnan precis tillräckligt för attfylla den helt. Tillåt ~ 1 min för agaros stelna.
  6. Placera hornhinnan med stödjande gelen ställningen epitelial sidan upp i en 35 mm vävnadsodlingsplatta och lägga odlingsmedium för att täcka epitelyta.
  7. Hornhinnan kan odlas på detta sätt i över en vecka, med medium förändringar varje 48 tim.

Del 3: Infektion med HSV-1 och Behandling med experimentella läkemedel

  1. Tillsätt 1 ml av medium innehållande den önskade mängden av virus i en 35 mm vävnadsodlingsplatta. Vi infektera vanligtvis med 1x10 4 PFU av stam KOS HSV-1 per hornhinnan. Vår lager titrar bestäms genom att utföra plackanalyser på CV-1-monoskikt.
  2. Placera hornhinnan tillsammans med agarosen schavotten epiteliala nedåt i virusinnehållande mediet.
  3. Placera hornhinnan i en vävnadsodlingsinkubator att infektera under 1 timme med intermittent skakning var 10-15 min.
  4. Efter 1 timme, aspirera virus-contaiNING medium och skölj 2-3 gånger med PBS för att avlägsna eventuella kvarvarande viruspartiklar.
  5. Placera hornhinnan tillbaka till sin tidigare position och lägga färskt odlingsmedium för att täcka den epiteliala ytan.
  6. Experimentella behandlingar kan startas före eller efter infektion, beroende på naturen av försöket.
  7. Odlingsmedium ändras varje 48 timmar.

Del 4: Provtagning

  1. Medium för plackanalys analys. Blanda medellång väl och använda den omedelbart för en plackanalys eller förvara vid -80 ° C för senare användning om insamling av prover vid olika tidpunkter.
  2. DNA, RNA, protein eller celler från korneaepitel
    1. Ta bort agarosen schavotten och skölj hornhinnan väl med PBS.
    2. Excise ringen av sklerala vävnad från hornhinnan för att säkerställa att endast korneaepitelet material uppsamlas.
    3. Usjunga en skalpell, skrapa bort korneaepitelialceller i lämplig buffert, beroende på typen av material som skall isoleras. För isolering av DNA och RNA, använder vi DNeasy Blood & Tissue Kit och RNeasy Mini Kit, respektive (Qiagen, Hilden, Tyskland). För insamling av proteinlysat använder vi Laemmli buffert. För flödescytometrianalys av korneala epitelceller, vi pre-inkuberas hornhinnor i en liten mängd trypsin att lossa cellerna, och sedan lossa dem till trypsin med en skalpell. Sedan skrapning hornhinneepitelet inte ger lika mycket vävnad, är det viktigt att inkludera lämpliga kontroller vid analys av proverna. Vi använder 18S rRNA som referens transkript i QRT-PCR, GAPDH som referens gen i qPCRs och nukleolin som Lastkontroll för Western blotting.
  3. Vävnadsprover för immunohistokemi eller immunofluorescens
    1. Ta bort agarosen schavotten och skölj majsea väl med PBS.
    2. Beroende på din experimentella mål, använd hornhinnan för att göra ett block paraffin vävnad eller en frusen vävnad block, som visas i videon. Vi följer standardförfaranden när de förbereder hornhinnan vävnadssnitt.

Representativa resultat

De flesta av de metoder som finns för att studera celler i vävnadskultur kan enkelt anpassas för användning i hornhinnor infekterade med HSV-1 ex vivo. Visas här är representativa resultat för några av de vanligaste teknikerna för att studera HSV-1-infektion - qPCR (figur 1D), QRT-PCR (figur 1B), Western blöt (figur 1F), plackanalys (figur 1C), och vävnad immunofluorescens (figur 1E).

Figur 1
Figur 1. Analys av hornhinnor infekterade med HSV-1 Ex motIvo. (A) Schematisk representation av ex vivo-modell av akut hornhinneepitel HSV-1-infektion. (BF) Analys av hornhinnorna infekterade med den metod som beskrivs i denna video artikeln. Explanterade kanin hornhinnor infekterades med 1x10 4 PFU / hornhinna av stam KOS HSV-1 och odlades i närvaro (PAA) eller frånvaro (Mock) i fosfonoättiksyra (400 pg / ml), en känd inhibitor av HSV-replikation. (B) Totalt RNA uppsamlades vid de angivna tidpunkterna, och viral transkription bedömdes med QRT-PCR med primers för HSV-1 polymeras. Primrar mot 18S rRNA användes som en referens. n = 3. Felstaplar anger ± SEM. (C) Odlingsmedium uppsamlades vid 48 HPI, och infektiös partikel produktionen bestämdes genom plackanalys på CV-1 monoskikt. (D) Totalt DNA uppsamlades vid 48 HPI, och viral genomreplikation bedömdes i en qPCR analys med primers för HSV-1-genomet. Primers mot GAPDH användes som en referens. n = 3. Felstaplar anger ± SEM. (E) Mock-behandlade hornhinnor flash-frystes vid 48 HPI, sektionerades och analyserades genom indirekt immunofluorescens med avseende på närvaro av ett viralt protein tidig (ICP8) inuti den infekterade epitelet. Kärnor motfärgades med Höchst 33.258. (F) Protein lysat uppsamlades vid 48 HPI, och expression av ett viralt protein (ICP0) bedömdes genom Western blöt. BCA-analys användes för att säkerställa lika laddning av prover. HPI = timmar efter infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna video artikeln beskriver vi en metod för att studera akut hornhinneepitel HSV-1-infektion i en ex vivo-modell. Denna modell är ett bra språngbräda mellan in vitro och in vivo-modeller, eftersom den möjliggör fysiologiskt korrekt validering av resultat cellodling och därmed begränsar mängden djurförsök som måste utföras. Dessutom ger den ex vivo-modellen en unik och ovärderlig möjlighet att studera epitelial herpesinfektion i intakta humana hornhinnor. Nedan är några överväganden som måste beaktas när man använder denna modell:

  • Det är viktigt att betona att den metod som beskrivs i den här videon artikel inte är tänkt att vara en modell av herpes keratit, utan är snarare en modell av akut hornhinneepitel HSV-1-infektion. Herpes keratit är ett resultat av flera störande processer, inklusive infektion, inflammation, och värd imMune svar på viruset. Antigenspecifika CD4 + och CD8 + T-cellssvar är en viktig del av patogenesen av herpes keratit, som inte kan reproduceras i denna modell, eftersom explanterade hornhinnor är inte föremål för infiltration av celler i immunsystemet. Av denna anledning inte utvecklar de inte de typiska epiteliala dendritiska sår och saknar den stromala engagemang klassiskt observerats i herpes stromal keratit 3. Därför, repning av sjukdomens svårighetsgrad och fluorescein avbildning av hornhinnesår är inte möjlig i ex vivo-modell. Dessutom är de flesta fall av herpes keratit orsakas av viral reaktivering från latens. Eftersom vår strategi bygger på direkt infektion av explanterade hornhinnor med exogent virus modellerna akut HSV-1 hornhinnan infektion och inte återaktivering sjukdom. Av dessa skäl är den modell som presenteras här inte är lämpligt för att förstå den övergripande patologi av sjukdomen, utan should användas för att studera viral replikation och virus-värd interaktioner strikt hornhinneepitelet.
  • Ex vivo herpes keratit modellen ger resultat med större variationer än in vitro vävnadskultur. Detta beror förmodligen på det faktum att varje hornhinna samlas in från en annan kanin och kan bearbetas något annorlunda. Mänskliga hornhinnor visar en ännu större variation av resultat än kanin hornhinnor, eftersom de kommer från donatorer av varierande ålder, ras och hälsotillstånd, och bevaras för olika tidsperioder obduktion. Men med hjälp minst fem hornhinnor per experimentell behandling, kunde vi generera statistiskt tillförlitliga uppgifter.
  • Den traditionella metoden för odling explanterade hornhinnor 4-5 föreslår användning precis tillräckligt odlingsmedium för att täcka limbus i hornhinnan. Vi fann att en ökning av mängden av mediet för att fullständigt täcka epitelet ger mer konsekventa resultat,sannolikt på grund av att minimera skillnaderna mellan enskilda hornhinnor tillgång till mediet och experimentella läkemedel däri.
  • När du använder kanin hornhinnor för alla tillämpningar använder antikroppar, är det viktigt att hålla i minnet att de traditionella antikroppar med specificiteter mot människa, mus, råtta, etc. sannolikt inte korsreagerar mot kanin antigener. Dessutom, kan sekundära anti-kaninantikroppar naturligtvis inte användas vid dessa tillämpningar. Av dessa skäl använder vi människor hornhinnor i experiment med antikroppar färgning av cellulära mål.
  • När samlar epitelceller för flödescytometrianalys måste försöksledaren vara försiktig om effekterna av trypsin på membranbundna proteiner. Sålunda, för detektion av ytproteiner, kan det vara fördelaktigt att använda andra medel för att rubba cellerna, såsom kollagenaser eller icke-trypsin proteaser.
  • Djurmodeller av herpes keratit beroende hornhinnan markberedning före inokulering medviruset. Vi har kunnat uppnå konsekvent nivåer av infektion utan markberedning de explanterade hornhinnor. Detta är mest sannolikt på grund av frånvaron av tårfilmen och blinka att snabbt eliminera viruset från hornhinnans yta i ett levande djur.

Potentiella ändringar i ex vivo herpes keratit modell utforskas inte i denna video artikeln:

  • Genetisk modifiering av korneala epitelceller före HSV-1-infektion genom att använda DNA-leverans används i cellkultur och i genterapi forskning, såsom transfektion, viral leverans, och gen gunning 6.
  • Användning av GFP-uttryckande HSV-1 7-8 eller FITC-konjugerat anti-HSV-antikroppar 9-10 visuellt bedöma omfattningen av infektionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Stödet från Lions Eye Bank of Delaware Valley var ovärderlig för detta arbete. Primär mus monoklonal antikropp mot ICP8 var en vänlig gåva från Dr David Knipe (Harvard Medical School). Vi tackar också Dr Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) och Dr Peter Laibson (Wills Eye Institute) för hjälp diskussioner och expertis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM) Mediatech, Inc. 10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution) Mediatech, Inc. 25-025-CI
L-Glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt Sigma-Aldrich P3032
Streptomycin Sulfate Salt Sigma-Aldrich S9137
Agarose Invitrogen 15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS) Prepared in Lab N/A
Trypsin EDTA (1x) Mediatech, Inc. 25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Laemmli Buffer Prepared in Lab N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
Whole Rabbit Eyes (Young) Pel-Freez Biologicals 41211-2
Human Corneas and Whole Eyes Local Supplier N/A
12 Well Porcelain Spot Plate Avogadro’s Lab Supply 1877
35 mm Tissue Culture Dish Falcon BD 353001
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Cryomold Intermediate Tissue-Tek 4566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
  2. Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
  3. Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
  4. Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
  5. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
  6. Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
  7. Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
  8. Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
  9. Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
  10. Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats