定植 Euprymna scolopes鱿鱼由弧菌鲵

Immunology and Infection

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Summary

方法概括的过程,其中夏威夷短尾鱿鱼,

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Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

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Abstract

与特定的细菌被发现在动物组织1-5。这种细菌主机协会(共生)可能是有害的(致病性),有没有健身的后果(共生),或有利于(互惠)。而备受人们关注已给病原相互作用,知之甚少的进程决定的有利/共生细菌的环境重现收购。轻器官之间的海洋革兰氏阴性菌共生五鲵和夏威夷短尾鱿鱼,E. scolopes,代表着一个非常具体的互动,其中一台主机(E. scolopes)建立贯穿其一生当然6,7只有一个菌种( 五鲵 )的共生关系。由五,生产发光在这种互动提供了一个反掠夺利益在8,9夜间活动scolopes,而营养丰富的宿主组织提供V。鲵与受保护的利基10。在每个主机上一代,这一关系的概括,从而较可预测的过程,可以在共生发展的各个阶段的详细评估。少年鱿鱼孵化aposymbiotically(uncolonized),并在实验室中,如果前30-60分钟内收集和转移到共生的自由水,不能被殖民除实验接种6。因此,这种互动提供了一个有用的模型系统,在其中进行评估,导致从11,12环境的共生微生物的具体收购的各个步骤。

在这里,我们描述了一种方法来评估发生刚出时aposymbiotic 大肠杆菌殖民化的程度scolopes暴露(人造)海水中含有五。鲵。这个简单的实验说明接种,自然感染和恢复E.新生的光器官的细菌共生scolopes。护理提供一个一致的环境共生的发展过程中的动物,尤其是关于水质和轻线索。特征描述的共生人口的方法包括:(1)的细菌派生发光的测量,(2)直接菌落计数恢复共生。

Protocol

1。细菌菌剂的制备

  1. 0天
    前两天鱿鱼接种,板13琼脂上的LBS相关的细菌株。
  2. 在25-28℃过夜孵育细菌。
  3. 第1天
    接种一五,各殖民地3毫升磅玻璃文化管中等株感染。准备作为备份的重复管。
  4. 第2天
    (协调细菌步骤与鱿鱼步骤3.7-3.10 1.4-1.6)
    1小时前接种,继代培养细菌1:80(37.5μL)3毫升的玻璃文化管定位,并成长为与曝气1小时。
  5. 测量样品的OD 600到接种前。典型的测量0.3-0.6取决于应变。
  6. 为目标接种3-5 x 10 3 CFU / ml的计算如下接种量:接种量(μl)= 1.25 /外径600(例如,外径600 = 0.5,计算接种量= 1.25/0.5 = 2.5微升)。这笔款项是直接添加到海水中含有步骤4.1鱿鱼。这种计算可能需要调整不同品系五鲵或更低或更高的水平比这里指定的接种。

2。琼脂板的制备菌剂的枚举

  1. 每次治疗,标签定位板(每治疗2)接种步骤4.1板样品。
  2. 添加5%无菌板电镀珠。

3。收集鱿鱼少年

  1. 即时使用验光仪的海洋测量盐度和调整到35‰。
  2. 过滤1 L即时使用的过滤装置和附加真空线或真空泵,生成过滤灭菌即时海洋(FSIO)的海洋。含氧水纷飞大力每个配药前。日可重复使用的E滤波器单元为2天。
  3. 分装成每两(2)一次性抽样碗40-50毫升FSIO。一个标签为earlies和作为timelies之一。
  4. 准备削减的移液器约1厘米最低的山脊,从上面的提示(见图3)获得少年鱿鱼的超过塑料转让移液器。这有利于更广阔的领域,鱿鱼,通过它可以通过后收集。放弃任何转移移液器,其中有一个粗略的外露表面。
  5. 使用准备转让移液器,收集E。一夜之间,孵化和转移到的FSIO earliesscolopes。早幼龟蛋系统已经在超过1小时,和容易受污染的殖民五鲵在蛋系统。不要使用敏感的殖民实验earlies。
  6. 检查蛋坦克每30-45分钟为新的幼体。确保所有幼体在每个C清除赫克。取出转移吸管,和存款到的FSIO timelies碗幼体。及时收集动物是殖民实验。
  7. 当收集完成后(约45分钟后,黄昏),鱿鱼转移到主要实验室。经验殖民不间断3小时接种实验室的光照条件下的动物是有利的。
  8. 每次治疗,准备一个碗与40毫升FSIO。加入鱿鱼检测碗(最高N = 40元一碗)。
  9. 准备作为aposymbiotic(负)控制额外碗。
  10. 每次治疗准备一个专用的移液管。
  11. 安乐死在2%的乙醇额外鱿鱼。

4。鱿鱼殖民

  1. 第2天-使用P10的Pipetman,分配到每碗鱿鱼(步骤3.8),每次治疗细菌计算等份(步骤1.5)。后,立即启动3小时定时器第一次接种。
  2. 每次治疗,创建“旋涡”在专用的移液管一碗碗的边缘附近放置移液器,移液器上下反复搅拌约10秒的水和鱿鱼。彻底混合是至关重要的。
  3. 从每碗板50μL到步骤2.2 LBS琼脂平板(技术复制,板治疗50%的的微升板)。孵育25-28°C过夜。
  4. 准备洗碗(100毫升FSIO / EA),每次治疗。
  5. 准备小瓶果蝇 (4毫升FSIO / EA)每个鱿鱼。
  6. 整整3小时后,各自洗碗(所有治疗)转让的鱿鱼。这将停止接种。
  7. 进行与FSIO转移自身的果蝇小瓶每一个人的鱿鱼。每次治疗使用指定的移液管。
  8. 果蝇瓶的托盘移动的鱿鱼设施的返回天/ N的飞行光周期的动物胚胎发育过程中经历。
  9. 第3天-准备果蝇瓶(4毫升FSIO / EA)为每个鱿鱼。
  10. 在22-24小时后接种黄昏之前,每个鱿鱼转移到一个新的果蝇小瓶。每次治疗使用指定的移液管。
  11. 第4天 -准备标记1.5 ml离心管(1/squid)。
  12. 在此之前黄昏在46-48小时后接种,测量和记录每个鱿鱼在果蝇小瓶(光度计一套6的整合与自动读取盖子封闭)的发光。
  13. 作为阴性对照的背景发光,测量与FSIO的小瓶,不包含任何鱿鱼。
  14. 体积约700μL步骤4.12至1.5毫升离心管中传输每个鱿鱼。移动纸板冷冻箱。一旦盖子被放置在包装盒上,不消除细菌驱逐光线索,它不WELL-理解。
  15. 离心管冻结在-80°C过夜。

5。殖民化水平的测定

  1. 对于每个鱿鱼,准备两(2)离心管中,每475μLFSIO(或高压灭菌70%的即时海洋)。
  2. 准备首先使用清理杵和删除总值的碎片和/或组织的Kimwipe杵。
  3. 地方杵尖,含95%乙醇50毫升烧杯中。乙醇应增加约3厘米的高度。
  4. 对于每一个杵,从烧杯中取出,擦拭与Kimwipe尖。
  5. 沾杵成乙醇浴,删除和插入(尖)到离心管架,并允许完全干燥空气约15分钟。
  6. 在离心管架鱿鱼解冻(最大N = 8)。
  7. 如有必要,调节音量至700μL。
  8. 从步骤5.5使用杵,扰乱动物组织,直到墨囊RUPtures(水会变成灰暗色)。
  9. 删除杵,并确保所有的组织仍然在管。
  10. 组织简要涡整整10秒(使用一个定时器)。
  11. 允许组织要休息10分钟。该组织将解决留在溶液中的细菌和油墨。按照计算,细菌/油墨解决方案的研究[A]稀释(即700μLE. scolopes光在器官匀浆)。串行1:20稀释([A],[])如下所述。
  12. 为[A]稀释,添加25μL[一]步骤5.1中编写的离心管。旋涡。
  13. 对于汇编[C]稀释,添加25μL[b]步骤5.1中编写的离心管。旋涡。
  14. 50板每到LBS的琼脂稀释液,2重复,每次治疗。
  15. 在25-28℃过夜孵育板。

6。数据分析

  1. 计算CFU /光器官(LO),coun10-400殖民地ţ殖民地盘上每次治疗在目前,并使用相应的计算公式:
    单位/ LO =([一]板殖民地)×14;
    单位/ LO =([b]板的殖民地)×280;
    单位/ LO =(论文集[C]板的殖民地)×5600。
  2. 绘制单个数据点规模对数和中位数。
  3. 数据往往不是正态分布,用不同的差异,离群可能含有生物有意义的信息。因此,非参数测试提供了一个有用的方法,以确定是否治疗差异显着。
  4. 使用统计分析软件GraphPad棱镜。对于两种治疗方法,使用Wilcoxon秩和检验。对于大于两个疗程之间的比较,使用适当的测试后,Kruskal-Wallis检验。

7。代表结果

从样品殖民检测结果如图4所示。两株大肠杆菌 ES114 14 scolopes共生,和光明Sepiola罗布斯塔共生的,SR5的15,16。类似的接种水平(图4A)3小时内导致100%的殖民。在48小时,发光水平(图4B)和CFU计数(图4C)被确定为殖民的应变能力的评估。允许每个过程中的共生菌的亮度测定的具体发光(图4D每细菌)的测定。

图1
图1。殖民化过程的流程图。细菌和鱿鱼收获分开,然后在指定的接种混合。鱿鱼洗净,然后转移到新的水在3小时,24小时和4 8小时后接种。在48小时发光测量和动物被冻结,其作用是表面消毒的动物。光器官定植细菌仍然可行-80°Ç通过一个解冻(没有额外的冻融)。

图2
图2。流程图,说明细菌的同质化和稀释电镀。定植细菌的枚举序列的20倍稀释液提供适当的动态范围。

图3
图3。适当窄轴锥度移液器转移到一个狭窄的孔(一),会损害青少年的鱿鱼。最窄的部分用剪刀或刀片切断预处理产生一个合适的工具(B)为转移少年鱿鱼。

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图4为殖民检测样本数据。 (一)细菌水平在接种碗。 (二)个别鱿鱼发光。 (三)个别鱿鱼的菌落计数。 (四)具体的个别鱿鱼发光。 APO,Aposymbiotic的(uncolonized阴性对照)。

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Discussion

描述的殖民法,允许在受控的实验室环境中的一种自然的共生过程的分析。因此,它可以用来评估由不同的自然株,突变株,并根据不同的化学制度的殖民化。通常用来描述实验上的变化,以评估不同方面的共生。可以测量殖民动力学检查在第一个24小时,它可以自动检测巧合探测器已被删除,在闪烁计数器的发光。此外,一个应变,相对于其他相对定植能力,可以通过有竞争力的殖民实验测量,其中产出比在一组动物的两株正常化的投入比例(差由不同的抗生素耐药性的检测,荧光或色[LacZ基因/ Xgal]标记)。最后,可以进行成像殖民直接聚焦MICRoscopy。

关键是要用于实验的健康少年鱿鱼。可怜的鱿鱼健康行为指标包括游泳界(安乐死的动物),或保持白色的动物,不改变他们的色素细胞,把一个黑暗的表面上棕色(小心使用)。由于存在在宿主种群的变化,更大数量的小动物复制实验往往是小数目比一个大样本的重复实验更有价值。

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Disclosures

作者没有透露。

Acknowledgements

作者感谢马蒂亚斯鱿鱼设施的支持和迈克尔·哈德菲尔德和Kewalo海洋实验室在现场收集的援助,并为这个协议作出贡献的Ruby和麦克福尔-艺实验室的成员在这个手稿的意见,Gyllborg。在曼德尔实验室的工作是支持由NSF IOS-0843633。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR international 47729-580
Caps for Glass Culture Tubes Fisher Scientific NC9807998
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega Corp. E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega Corp. E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster & Smith CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith CD-16881 Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalge Nunc international 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR international 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher Scientific BP2818-100
Pestles Kimble Chase 749521-1500
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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