从使用吸吸液管技术的嗅觉受体神经元的气味引起的反应记录

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Neuroscience

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Summary

嗅觉受体神经元(ORNs)气味信号转换成一个受体的电流,从而触发动作电位,被输送到第二个神经元在嗅球中。这里,我们描述的吸入移液管的技术,同时记录从小鼠ORNs电流和动作电位的加臭剂诱导的受体。

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Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R., Reisert, J. Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique. J. Vis. Exp. (62), e3862, doi:10.3791/3862 (2012).

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Abstract

动物采样的臭味通过化学感受系统位于鼻腔周围环境。化学感受信号的复杂行为的影响,如食物的选择,捕食,同种和配偶识别和其他社会有关的线索。位于嗅觉受体神经元(ORNs)中嵌入鼻腔的嗅觉上皮细胞背侧部分。这些双极神经元的轴突发送到嗅球见图1,Reisert1,最初发表于普通生理学杂志“)和扩展的单枝晶的纤毛辐射到的粘液覆盖的嗅觉上皮细胞的边界上皮细胞。的纤毛包含的信号转导机制,最终导致兴奋性通过睫状转导通道,环核苷酸门控通道(CNG)的Ca 2 +活化的Cl -的信道( 图1)流入的电流。随之而来的depola三丙触发在电池主体2-4的动作电位的产生。

在这个视频中,我们描述了使用的“吸吸液管技术”,记录的气味引起的反应ORNs。该方法最初发展到记录从杆感光体5和jove.com修改,以记录从鼠标锥感光体6,可以发现在该方法的一个变种。后来被改编吸入吸液管技术也记录ORNs 7,8。简要地说,在解离的嗅觉上皮细胞和细胞分离后,整个细胞的ORN体被吸入到的记录吸管的前端。枝晶和纤毛仍然暴露于沐浴液,从而解决方案的变化,例如,使气味或药物受体阻滞剂的应用。在此配置中,还没有进入到细胞内环境获得(的没有全细胞电压钳)和细胞内的电压保持自由变化。这一切都OWS受体电流缓慢,起源于发射的细胞体9纤毛和快动作电位的同时记录。动力学这两个信号之间的差异在允许它们被分开使用不同的过滤器设置。这种技术可以用在任何野生型或基因敲除小鼠,或选择性地从记录ORNs也表达GFP标记的特定子集ORNs,例如表示一个给定的加臭剂的受体或离子通道。

Protocol

1。录像设置

的记录室被安装在尼康TE2000U Eclipse的倒置显微镜相衬嵌合的光学上的气动工作台和电屏蔽使用一个法拉第笼。有机玻璃录音室包括两个部分,由阻挡层部分分离,并粘附到硅烷化的载玻片。该室的部分之一是用来解决细胞,而另一种是用于在录制过程中,以尽量减少刺激曝光过早曝光的结算,但尚未使用的单元格,以加臭剂。的记录设置包括的吸入移液管(见下文),其安装在一个沉淀的吸液管保持和接地电极。使用一台显微吸入吸液管的位置。激励信号的解决方案应用于使用三重桶的玻璃的方管,每个为0.7毫米×0.7毫米的方管。的三重管玻璃连接到机动化的快速步骤灌注系统,其安装在一个机械手(述之三,华纳仪器SF-77B)和输入的记录室,在〜45°的角度。三重桶玻璃的端部被斜切再次使得最后面(开口)的三重管玻璃是垂直的,以允许接近定位的移液器45°的角度处。

的吸入移液管填充有标准的哺乳动物Ringer溶液和接地电极的电极被连接到1GΩ探头在电压钳位模式的膜片钳放大器(PC-501A,华纳仪器)。从放大器(低通滤波的在5千赫)的模拟信号被显示在数字示波器在实时监测的信号,并还连接到一个8极贝塞尔滤波器(克罗恩音乐-海特),其中该信号是低通滤波在50 Hz。这两个信号(在5千赫和50赫兹的低通滤波的)被馈送到一个A / D转换器(剑桥电子设计微1401 mkII使用的),其连接到PC上的数据采集。使用信号3 ACQ数据被记录uisition软件(剑桥电子设计)的采样频率为10 kHz。首先记录的受体电流一起叠加后的动作电位,然后单独的受体电流(参照图2),该信号被记录在两个不同的带宽。灌注系统使用林格氏液(对照组)的溶液,加臭剂的刺激或任何所希望的组合物的溶液之间快速切换,并控制由PC和信号3软件。这些解决方案都包含在60毫升的注射器,由医疗级静脉流动调节器和流量控制。通常情况下,流率被设定为1毫升/分钟。

记录移液管上的吸入控制在以下的方式:吸液管保持器的侧端口的连接线又被连接到一个高度可调的贮油的油。提高或降低水库确保吸液管压力和因此林格氏流的通过在p的前端ipette是最小的,稍微积极。额外的吸力或压力可应用于通过管与吹嘴的另一端连接到空域水库吸记录移液管的尖端的一个孤立ORN进入细胞体。

实验是在37℃下进行,以便密切模拟本机的细胞生理状态的。将温度控制通过的解决方案,通过量身定制的加热单元,其由陶瓷电阻器,通过该不锈钢管中含有的解决方案被传递10。使用热电偶温度计克(Fluke)的温度监测。

2。解决方案

哺乳动物Ringer氏溶液(毫摩尔):140的NaCl,5氯化钾的MgCl 2,1,2的CaCl 2,0.01 EDTA,10 HEPES,10葡萄糖。用NaOH将pH调节至7.5。使用了10%的稀释的林格氏溶液测量结电流。菌种NT解决方案:苯乙酮和丁子香酚,每天在林格氏液从20毫米DMSO股票。

3。使电极

  1. 将在萨特P-97微吸管拔出器的unfilamented硼硅玻璃毛细管拉微量长锥形。
  2. 移液管转移到一个特制的的微量移液器支架安装在尼康E200的Eclipse的显微镜,这是又配有一个十字线的目镜和一个可移动的安装在舞台上的钻石刀。
  3. 观察,20x的目标下的吸移管的前端,作为指南,使用分划板;轻轻划线的吸移管以90°的角度使用吸移管的宽度为10μm,(外径)的量身定制的钻石刀。
  4. 进一步移动的钻石刀向尖部,并逐步将用金刚石刀的前端上的压力。吸头在被刻划的地步,要打破干净。

另外步骤3.13.4可以结合起来的情况下直接切吸头,吸液管可以拉动所需的尺寸,但它可以证明很难可靠地拉移液管这么大的齿顶圆直径和干净切白边。

  1. 下一个40倍的目标,火抛光的前端的移液管的内直径为5μm,使用电加热的灯丝。一旦完成后,微管是准备用于记录电流从鼠标ORNs。应该是开放的吸液管电阻约1MΩ时,充满了林格。

4。嗅觉受体神经元的分离

  1. 牺牲一个鼠标跟随机构的指导方针和法规。移开磁头,剥离的皮肤覆盖在颅骨内平分头,沿中线。
  2. 解剖体视显微镜下,将两个半头,拉断的鼻中隔和删除的嗅觉鼻甲。将所有的组织培养皿中的葡萄糖Containing哺乳动物的林格氏液。
  3. 剥离脱落上皮的底层的软骨从两个鼻甲的嗅觉和组织转移到含有250μL林格氏液的Eppendorf管中。我们使用2鼻甲组织,以获得合适的细胞密度的大小,我们的录音室。存储的其它组织,在4℃,供以后使用。
  4. 涡的Eppendorf管中含有的嗅觉上皮细胞两次简要以中等速度为1秒。此步骤导致从上皮ORNs机械分离。
  5. 放置的记录室中含有的解离ORNs Ringer溶液。卸下大块的组织也存在于暂停用细镊子。
  6. 我们,ORNs解决与振铃前20分钟开始连续灌流和进行的录音。

5。录音

  1. 降低吸入油线电极连接到记录室和REGUL吃的贮油腔的高度,在移液管尖建立微正压。这是可以做到通过观察如细胞碎片远离(正压)或朝向(负压)的吸移管移动。尽量不污染的移液管的前端与细胞碎片。
  2. 扫描为一个孤立的的ORN能够识别其典型的双极形态使用的倍率为20-40x的记录室。移动的记录电极,为ORN电池主体的接近。轻轻开始抽吸,使该单元体的移液管的尖端进入。小心地,慢慢地继续适用于吸入,直到整个细胞体被吸入到吸入移液管的尖端,留下的枝晶的浴溶液和纤毛暴露。吸的ORNs和吸管形状的图像,看到7,11。确保,一旦没有吸,ORN不移动或吸管的。如果是这样,相应地调整高度的贮油腔。
  3. 使用显微操作,从部分包含结算ORNs到记录部分的腔室中移动的吸入移液管。在前面的解决方案交换管的管,小心地将吸吸液管。的吸入移液管应放置在靠近到足以3长筒管的开口,使得ORN露出到层流,从而避免混合湍流,并实现快速的溶液交换。溶液交换实现步进横跨吸入移液管的尖端的流动溶液的并行数据流之间的接口。的溶液交 ​​换过程中的时间通常是20毫秒左右,诱发通过步进细胞不同的离子组合物之间的解决方案(参见图2)从交界处电流测量。解决方案交付重力。
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6。代表性的成果

图1。
图1:A)双极型受体在嗅球神经元。 B)信号转导机制中的纤毛,最终导致兴奋性电流涌入。随后的去极化触发在电池主体的动作电位的产生。

图2。
图2示出的溶液交 ​​换的速度和可靠性。一个移液管加强从正常到10%的稀林格氏液为100毫秒交界处的电流,从而从不同的离子浓度。黑色的轨迹是在大街愤怒的5项试验中,红色追踪它的SD。在解决方案交流演示的变化不大,SD解决方案交换的可靠性试验,试验和缺乏任何一种解决方案中多余的噪音。

图3。
图3示出了从ORN使用吸入移液管技术的丁子香酚诱导响应。 ORN被暴露于100μM的丁子香酚,1秒,如所指示的记录的栏上面。另外图3A(黑线)受体电流在0 - 50赫兹的带宽过滤,只显示受体电流。 图。图3B示出的相同的记录,现在过滤在宽的带宽为0 - 5000赫兹(红色迹线),还显示动作电位(受影响,由箭头表示)。插图示出在一个扩展的时间刻度的可视化受影响更清楚地在发病的响应相同的跟踪。

图4。 图4。剂量反应(A)的丁子香酚响应ORN家庭。丁子香酚,用于浓度范围从0.3μM至100μM,刺激的持续时间为1秒,并过滤,在0 - 50赫兹的痕迹。的渐进的加臭剂的浓度增加导致更大范围和更快的响应,这也终止的更慢,一旦加臭剂曝光终止。

ORNs可以显示在中间的加臭剂的浓度( 图4B)在长刺激的振荡响应模式。这里一个acetephenone(3μM),响应ORN刺激持续8秒。在发病的刺激经过快速和瞬态的峰值响应一系列观察到较小的,经常性的反应。记录带宽为0 - 50赫兹。

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Discussion

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Disclosures

作者有没有透露。

Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院DC009613,人类前沿科学计划和莫雷护理奖学金(JR)的支持。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Air table equipment Newport Corp.
Air Pump equipment Newport Corp. ACGP
Pipette Puller equipment Sutter Instrument Co. P-97
Borosilicate glass equipment World Precision Instruments, Inc. 1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope equipment Nikon Instruments TE2000U Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A equipment Warner Instruments 64-0008 Headstage 1 GΩ
Diamond knife Equipment Custom Made
Digitizer Mikro1401 A/D equipment Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382 equipment Krohn-Hite Co.
Signal software Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet equipment World Precision Instruments, Inc. 64-1297
Pipette holder equipment Warner Instruments 64-0997 Custom modified to fit
headstage
Recording chamber Equipment Custom Made
Micromanipulator MP85-1028 equipment Sutter Instrument Co. Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil Solution Sigma-Aldrich 330779-1L
Oscilloscope TDS 1001 equipment Tektronix, Inc.
Three-barreled square glass tube Equipment Warner Instruments 64-0119 0.6 mm ID , 5 cm long
Valve equipment The Lee Company
Valvelink 8.2 equipment AutoMate Scientific, Inc.
SF-77B Perfusion fast step equipment Warner Instruments

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References

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