Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

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Summary

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

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Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

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Abstract

Agarose-Gelelektrophorese ist der effektivste Weg zur Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe im Bereich von 100 bp bis 25 kb 1. Agarose wird aus dem Seegras Gattungen Gelidium und Gracilaria isoliert und besteht aus wiederholten Agarobiose (L-und D-Galactose) Untereinheiten 2. Während Gelierung, assoziieren Agarose-Polymere nicht-kovalent und bilden ein Netzwerk von Bündeln, deren Porengröße eines Gels bestimmen die Eigenschaften molekularer Siebung. Die Verwendung von Agarosegelelektrophorese revolutioniert die Trennung von DNA. Vor der Verabschiedung von Agarosegelen wurde die DNA in erster Linie getrennt mit Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, die nur unter der Voraussetzung eine Annäherung an Größe. Um die DNA unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese zu trennen, wird die DNA in vorgefertigten Vertiefungen in dem Gel und einem angelegten Strom geladen. Die Phosphat-Rückgrat der DNA (oder RNA) Molekül negativ geladen ist, damit, wenn sie in einem elektrischen Feld platziert wird, um DNA-Fragmente der p migrierenositively geladenen Anode. Da die DNA weist eine einheitliche Masse / Ladungs-Verhältnis, werden DNA-Moleküle nach Größe in einem Agarosegel in einem solchen Muster, dass die Strecke umgekehrt proportional zu dem Protokoll seiner Molekulargewicht 3 getrennt ist. Das führende Modell für die DNA-Bewegung durch ein Agarosegel ist, wobei die Vorderkante nach vorne bewegt und zieht den Rest des Moleküls entlang 4 "Reptation voreingenommen". ; 2) Agarose-Konzentration; 3) DNA-Konformation 5; 4) angelegten Spannung, 5) Gegenwart von Ethidiumbromid, 6), Typ 1) Größe des DNA-Moleküls: Die Rate der Migration von einem DNA-Molekül durch ein Gel wird durch folgende Faktoren bestimmt Agarose und 7) Elektrophoresepuffer. Nach der Trennung können die DNA-Moleküle unter UV-Licht sichtbar gemacht nach dem Färben mit einem geeigneten Farbstoff. Durch Einhalten dieses Protokoll sollen die Studierenden in der Lage:

  1. Verständnis des Mechanismus, durch den DNA-Fragmenten innerhalb einer Gelmatrix getrennt werden
  2. Verstehen Sie, wie die Konformation desDNA-Molekül seine Mobilität durch einen Gel-Matrix zu bestimmen
  3. Identifizieren Sie ein Agarose-Lösung geeigneter Konzentration für ihre Bedürfnisse
  4. Bereiten Sie ein Agarosegel für die Elektrophorese von DNA-Proben
  5. Richten Sie die Gelelektrophorese Apparate und Stromversorgung
  6. Wählen einer geeigneten Spannung für die Trennung von DNA-Fragmenten
  7. Verständnis des Mechanismus, durch den Ethidiumbromid ermöglicht die Visualisierung von DNA-Banden
  8. Bestimmen Sie die Größen der aufgetrennten DNA-Fragmente

Protocol

1. Herstellung des Gels

  1. Abwiegen die entsprechende Masse an Agarose in einen Erlenmeyerkolben. Agarosegele werden unter Verwendung von w / v Prozentsatz Lösung. Die Konzentration der Agarose in einem Gel wird auf der Größe der DNA-Fragmente abhängen, getrennt, wobei die meisten Gele im Bereich zwischen 0,5% -2% beträgt. Das Volumen des Puffers sollte nicht größer sein als 1/3 der Kapazität des Kolbens.
  2. In Laufpuffer der Agarose-enthaltenden Flasche. Schwenken Sie zum Vermischen. Die häufigste Gel Laufpuffer sind TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA).
  3. Schmelzen Sie die Agarose / Puffer-Mischung. Dies wird am häufigsten durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen durchgeführt, kann aber auch über einen Bunsenbrenner durchgeführt werden. Bei 30 s-Intervallen, entfernen Sie den Kolben und schwenken, um den Inhalt gut mischen. Wiederholen, bis die Agarose vollständig gelöst hat.
  4. In Ethidiumbromid (EtBr) auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml. Alternativ kann das Gel auch nach elektro gefärbt werdenphorese in Laufpuffer enthält 0,5 mg / ml EtBr für 15-30 min, von Entfärben in Laufpuffer für eine gleich lange Zeit an.

Hinweis: EtBr ist im Verdacht, krebserzeugend und müssen fachgerecht pro Institution Vorschriften entsorgt werden. Handschuhe sollten immer getragen beim Umgang mit EtBr-Gele werden. Alternative Farbstoffe für die Färbung von DNA zur Verfügung, jedoch EtBr bleibt die beliebteste aufgrund seiner Empfindlichkeit und Kosten.

  1. Lassen Sie die Agarose, um entweder auf dem Labortisch oder durch Inkubation in einem 65 ° C warmes Wasserbad abkühlen. Andernfalls wird verziehen den Gelträger.
  2. Setzen Sie den Gelträger in die Gießvorrichtung. Alternativ kann man auch kleben die offenen Kanten eines Gelträger, um eine Form zu erzeugen. Setzen Sie einen geeigneten Kamm in das Gel Form, um die Brunnen zu schaffen.
  3. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur eingestellt. Nehmen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer. Alternativ kann die gel kann auch in Folie eingewickelt und bei 4 ° C bis zur Verwendung (1).

2. Einrichten von Gel-Apparatur und Trennung von DNA-Fragmenten

  1. In Ladepuffer zu den DNA-Proben zu trennen (Abb. 2). Gel Ladungsfarbstoff wird typischerweise bei 6X Konzentration (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 30% Glycerin) hergestellt. Lädt Farbstoff hilft Ihnen wieder, wie weit Ihre DNA-Probe gereist, und ermöglicht auch die Probe in das Gel zu versenken.
  2. Programm die Stromversorgung gewünschte Spannung (1-5V/cm zwischen den Elektroden).
  3. In genug läuft, Puffer, um die Oberfläche des Gels bestimmt. Es ist wichtig, um die gleiche Laufpuffer wie die zur Herstellung des Gels verwendet.
  4. Befestigen Sie die Kabel des Gel-Box an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie sicher, dass sowohl Gel Box und Stromversorgung arbeiten.
  5. Nehmen Sie den Deckel. Langsamund sorgfältig zu laden die DNA-Probe (n) in das Gel (Abb. 3). Eine entsprechende DNA-Größenmarker sollte immer zusammen mit experimentellen Proben beladen werden.
  6. Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Die Kathode (schwarze Leitungen) sollte näher sein als die Brunnen der Anode (rote Leitungen). Überprüfen Sie, dass die Elektroden in die richtigen Schlitze in der Stromversorgung angeschlossen sind.
  7. Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff zu einem angemessenen Abstand migriert wurde.

3. Beobachten aufgetrennten DNA-Fragmente

  1. Wenn Elektrophorese beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung und entfernen Sie den Deckel der Elektrophoresekammer.
  2. Entfernen Gel aus dem Gel Box. Überschuss ablaufen lassen Puffer von der Oberfläche des Gels. Setzen Sie den Gelträger auf Küchenpapier, jede zusätzliche Laufpuffer absorbieren.
  3. Entnehmen Sie das Gel aus dem Gel Tray und setzen Sie das Gel mit UV-Licht. Dies wird meist geschieht mit Hilfe eines Gel-Dokumentations-System (Abb. 4). DNA-Banden soll zeigen,als orange fluoreszierenden Bändern. Machen Sie ein Foto des Gels (Abb. 5).
  4. Entsorgen Sie die Gel-und Laufpuffer pro Institution behördlichen Vorschriften entsorgen.

4. Repräsentative Ergebnisse

5 zeigt ein typisches Ergebnis nach einer Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten. Nach der Trennung werden die erhaltenen DNA-Fragmente sichtbar klar definierten Bands. Die DNA-Standard oder einer Leiter sollte auf ein Maß, das für den nützlichen Bestimmung der Größe der Stichprobe erlaubt Bands getrennt werden. In dem gezeigten Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 bp, 880 bp und 1022 bp auf einem 1,5% Agarosegel mit einem 2-log-DNA-Leiter getrennt.

Abbildung 1.
1. Eine erstarrte Agarosegel nach der Entfernung des Kamms.

Abbildung 2.
Abbildung 2. Eine Studentin und fügt Ladefarbstoff ihr DNA-Proben.

Abbildung 3.
Abbildung 3. Ein Student Laden der DNA-Probe in einen Brunnen im Gel.

Abbildung 4.
4. Ein Beispiel für ein Geldokumentationssystem.

Abbildung 5.
Bild 5. Ein Bild von einem Gel nach der Elektrophorese. EtBr wurde an das Gel vor der Elektrophorese in einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml, durch Trennung bei 100 V für 1 Stunde zugegeben, gefolgt. Das Gel wurde mit UV-Licht und das Bild mit einem Gel-Dokumentations-System übernommen ausgesetzt.

Discussion

Agarosegelelektrophorese hat sich als effiziente und effektive Art und Weise der Trennung von Nukleinsäuren sein. Agarose die hohe Gelfestigkeit kann für die Behandlung von geringen Prozentsatz Gele für die Trennung von großen DNA-Fragmenten. Molekularsiebkohle wird durch die Größe der Poren durch die Bündel von Agarose 7 in der Gelmatrix erzeugt wird. Im Allgemeinen, je höher die Konzentration von Agarose, desto kleiner ist die Porengröße. Traditionelle Agarosegelen sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb. Um DNA-Fragmente, die größer als 25 kb zu trennen, wird eine Notwendigkeit, Puls-Feld-Gelelektrophorese 6, die die Anwendung von Wechselstrom aus zwei unterschiedlichen Richtungen einbezogen werden, verwenden. Auf diese Weise größer dimensionierte DNA-Fragmente werden durch die Geschwindigkeit, mit der sie sich neu orientieren mit den Änderungen in der aktuellen Richtung getrennt ist. DNA-Fragmente kleiner als 100 bp getrennt sind wirksamer unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Im Gegensatz zuAgarosegelen, wird das Polyacrylamid-Gel-Matrix durch eine Radikalpolymerisation angetriebenen chemischen Reaktion gebildet. Diese Gele sind dünner höherer Konzentration, sind vertikal verlaufen und haben eine bessere Auflösung. In der modernen DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese verwendet wird, wobei Kapillarröhrchen mit einer Gelmatrix gefüllt. Die Verwendung von Kapillarröhrchen ermöglicht die Anwendung von hohen Spannungen, wodurch die Trennung von DNA-Fragmenten (und die Bestimmung der DNA-Sequenz) schnell.

Agarose kann modifiziert werden, um niedrig schmelzende Agarose durch Hydroxyethylierung zu erstellen. Niedrig schmelzende Agarose wird im Allgemeinen verwendet, wenn die Isolierung von DNA-Fragmenten getrennt erwünscht ist. Hydroxyethylierung verringert die Packungsdichte der Agarose-Bundles, eine effektive Senkung ihrer Porengröße 8. Dies bedeutet, dass ein DNA-Fragment der gleichen Größe länger dauert, bis durch eine leicht schmelzendem Agarosegel, um ein Standard-Agarosegel gegenüberliegenden bewegen. Da die Bündel miteinander verbindendurch nicht-kovalente Wechselwirkungen 9, ist es möglich, wieder schmilzt ein Agarosegel nach der Aushärtung.

EtBr ist die häufigste Reagenz verwendet, um DNA in Agarosegelen 10 zu färben. Wenn UV-Licht ausgesetzt, Elektronen in dem aromatischen Ring der Ethidium-Molekül aktiviert werden, führt die zur Freisetzung von Energie (Licht) als Elektronen zurück zum Grundzustand. EtBr funktioniert durch Einlagern sich in der DNA-Moleküls in einer konzentrationsabhängigen Weise. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Menge an DNA in einer bestimmten DNA-Bande auf ihrer Intensität. Aufgrund seiner positiven Ladung reduziert die Verwendung von EtBr die DNA-Migration Rate um 15%. EtBr ist ein Verdächtiger mutagen und karzinogen, also muss man Vorsicht walten lassen beim Umgang mit Agarosegelen enthält es. Darüber hinaus ist EtBr als Sondermüll und müssen entsprechend entsorgt werden. Alternative Flecken für DNA in Agarosegelen gehören SYBR Gold, SYBR Green, Kristallviolett und Methyl Blue. Von diesenMethyl Blue, Crystal Violet erfordern keine Exposition des Gels mit UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Banden, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Mutation wenn die Wiederherstellung der DNA-Fragment aus dem Gel gewünscht wird. Allerdings sind die Empfindlichkeiten niedriger als die von EtBr. SYBR Gold und SYBR Green sind beide sehr empfindlich, UV-abhängige Farbstoffe mit geringere Toxizität als EtBr, aber sie sind wesentlich teurer. Darüber hinaus, alle alternativen Farbstoffe können entweder nicht oder nicht gut funktionieren, wenn sie direkt zu dem Gel gegeben, damit das Gel muss nach gebeizt nach der Elektrophorese. Wegen der Kosten, einfache Handhabung, und die Empfindlichkeit, EtBr bleibt noch der Farbstoff der Wahl für viele Forscher. Doch in bestimmten Situationen, z. B. wenn die Entsorgung gefährlicher Abfälle ist schwierig, oder wenn junge Studenten sind der Durchführung eines Experiments kann eine weniger giftige Farbstoff bevorzugt werden.

Lädt Farbstoffe in Gel-Elektrophorese verwendet dienen drei wichtige Zwecke. Zuerst fügen sie hinzu Dichte der Probe, So dass sie in das Gel zu versenken. Zweitens bieten die Farbstoffe Farbe und den Ladevorgang zu vereinfachen. Schließlich bewegen sich die Farbstoffe in Regelsätze durch das Gel, so dass für die Abschätzung der Entfernung, die DNA-Fragmente migriert.

Die genaue Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente können durch Auftragen der log des Molekulargewichts für die verschiedenen Bereiche von einer DNA-Standard gegen den Abstand von jedem Band erneut bestimmt werden. Die DNA-Standard enthält eine Mischung von DNA-Fragmenten von vorbestimmten Größen, die gegen die unbekannten DNA-Proben verglichen werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Formen von DNA durch das Gel mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen. Superspiralisierter Plasmid-DNA, aufgrund ihrer kompakten Konformation, bewegt sich durch das Gel am schnellsten, gefolgt von einem linearen DNA-Fragment der gleichen Größe, mit der offenen Kreisform reisen die langsamste.

Abschließend, da die Annahme von Agarosegelen in den 1970er Jahren für die Trennung von DNA, hatsich als eines der nützlichsten und vielseitigsten Techniken in den biologischen Wissenschaften Forschung sein.

Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I Amresco 0710
Boric acid Sigma-Aldrich B7901
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
Glycerol Fisher Scientific G33-1
Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

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References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. 3rd, (2001).
  2. Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. 9-22 (1991).
  3. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
  4. Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
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  6. Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
  7. Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
  8. Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
  9. Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
  10. Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).

Comments

5 Comments

  1. Well understood................great explanation

    Reply
    Posted by: Muhammad Rizwan A.
    February 27, 2015 - 4:01 PM
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  3. too good

    Reply
    Posted by: Rosella B.
    April 26, 2015 - 10:12 AM
  4. Thank you!

    Reply
    Posted by: Axel W.
    November 30, 2016 - 1:55 AM
  5. very clear thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2017 - 6:11 AM

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