Hydrophobe Salz-modifizierte Nafion zur Enzymimmobilisierung und Stabilisierung

Bioengineering

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Summary

In diesem Artikel wird das Verfahren zur Synthese eines hydrophob modifizierten Nafion Membran und Enzymimmobilisierung, wie Proteine ​​und / oder Enzyme in der Membran zu immobilisieren und Testen ihrer spezifischen Aktivität beschreiben.

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Meredith, S., Xu, S., Meredith, M. T., Minteer, S. D. Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization. J. Vis. Exp. (65), e3949, doi:10.3791/3949 (2012).

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Abstract

Im letzten Jahrzehnt gab es eine Fülle von Anwendungen für Enzyme immobilisiert und stabilisiert einschließlich Biokatalyse, Biosensoren und Biobrennstoffzellen. 03.01 In den meisten bioelektrochemische Anwendungen werden Enzyme oder Organellen auf einer Elektrodenoberfläche mit dem Einsatz von irgendeiner Art von immobilisierten Polymermatrix. Diese Polymer-Gerüst, sollten sich die Enzyme stabil und ermöglichen die einfache Diffusion von Molekülen und Ionen in die und aus der Matrix. Die meisten Polymere für diese Art der Immobilisierung verwendet werden auf der Grundlage Polyamine oder Polyalkohole - Polymere, die die Natur der Enzyme, dass sie und kapseln Stabilisierung des Enzyms durch Wasserstoff oder ionische Bindung zu imitieren. Ein weiteres Verfahren zur Stabilisierung von Enzymen ist die Verwendung von Micellen, die hydrophoben Regionen, die einzukapseln und stabilisieren Enzyme enthalten kann. 4,5 Insbesondere hat die Minteer Gruppe eine mizellare Polymer auf im Handel erhältlich Nafion entwickelt. 6,7 Nafionselbst ist ein Polymer, das micellare für den Kanal-unterstützte Diffusion von Protonen und anderen kleinen Kationen ermöglicht, aber die Micellen und Kanäle sind extrem klein ist und das Polymer sehr sauer durch Sulfonsäure Seitenketten, was ungünstig für Enzymimmobilisierung ist. Wenn jedoch Nafion mit einem Überschuß an hydrophoben Alkyl Ammoniumsalze, wie Tetrabutylammoniumbromid (TBAB) gemischt wird, ersetzen die quaternäre Ammoniumkationen die Protonen und werden die Gegenionen zu den Sulfonatgruppen an der Polymerseitenketten (1). Dies führt zu größeren Micellen und Kanälen innerhalb des Polymers, das für die Diffusion von großen Substraten und Ionen, die notwendig für die enzymatische Funktion wie Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) sind zu ermöglichen. Diese modifizierte Polymer Nafion wurde verwendet, um viele verschiedene Arten von Enzymen sowie Mitochondrien für den Einsatz in Biosensoren und Biobrennstoffzellen immobilisieren. 12.08 Dieser Beitrag beschreibt ein neuartiges Verfahren für die Herstellung dieser micEllar Polymer Enzymimmobilisierung Membran, die Enzyme stabilisieren können. Die Synthese des mizellenförmigen Enzymimmobilisierung Membran, dem Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen in der Membran und den Assays zur Untersuchung enzymatische spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms sind unten aufgeführt.

Protocol

1. Modifizierung von Nafion mit quartären Ammoniumsalzen

  1. Schütteln eine Flasche von 5% w / v Nafion Suspension kräftig für ca.. 30 Sekunden bis die Nafion gewährleistet ist, gleichmäßig in der Lösung suspendiert.
  2. Pipette aus 2 ml der nun erneut suspendiert Nafion in einen Glaskolben (Fläschchen Volumen konnte von 2,5 ml bis 10 ml enthalten).
  3. Messen einer 3-fachen molaren Überschuss (bezogen auf die Sulfonsäuregruppen der Nafion-Polymer) des Alkylammonium Bromidsalz (gegebenenfalls Massen sind in Tabelle 1 gezeigt) und addieren, um das Fläschchen mit dem 2 ml Nafion.
  4. Vortex das Fläschchen bei 1500 rpm für 10-15 Minuten.
  5. Gießen Sie die viskose Lösung in einen Kunststoff Waagschale, die ca. misst. 3 x 3 cm, und verwenden Sie eine Pipette, um das restliche Lösung aus der Durchstechflasche zu übertragen auf die Waagschale.
  6. Lassen Sie die Lösungsmittel zu verdampfen aus dem Gewicht Boot, wobei ein gelb / braun, transparenten Films auf dem Boden der Waagschale (FiBild 2). Die Geschwindigkeit der Verdampfung des Lösungsmittels sollte so sein, dass es mehr als 6 Stunden für alle Lösungsmittel verdampfen erfolgt. Wenn das Lösungsmittel verdunstet zu schnell, wird ein weißes, knusprigem Material anstelle Form eines transparenten Films anzeigt, dass der mizellaren Struktur des Polymers zerstört worden ist, und Sie müssen neu starten Sie den Vorgang. Wenn Lösungsmittelverdampfung zu langsam ist, kann eine de-Luftbefeuchter erforderlich sein, weil zu langsam, der Verdunstung führt typischerweise zu einer klebrigen, orange Gel und Sie müssen neu starten Sie den Vorgang. Typische Temperaturbereiche für Lösungsmittelverdampfung sind 20 bis 37 ° C. Die tatsächlichen Bedingungen für das Trocknen eine Funktion der relativen Feuchte und Temperatur in dem Raum, aber es ist wichtig, dass das Trocknen wobei langsam Mizellenstruktur beizubehalten, aber nicht zu langsam, um die Gelbildung zu ermöglichen.
  7. Füllen Sie das Boot wiegt mit 18m Qcm de-ionisiertem Wasser (10-20 ml Wasser), Abdeckung, und lassen Sie sie für 12-24 Stunden einweichen, um überschüssige Alkylammonium Bromidsalze und HBr zu entfernen.
  8. Lassen Sie die Waagschale auf die unbedeckten sitzen, bis das Polymer vollständig trocken ist An dieser Stelle sollte das Polymer eine klare und etwas spröde Kunststoff-Folie sein. Auch wenn die Luft sehr feucht ist, kann eine de-Luftbefeuchter erforderlich sein, die Verdunstung in einer fristgerechten Weise zu vervollständigen.
  9. Mit einem Spatel vorsichtig die getrocknete Film aus der Waagschale und übertragen sie in ein sauberes Glasgefäß.
  10. Geben Sie 2 ml Ethanol und 3 Keramik-Misch-Perlen und Wirbel für 4 Stunden oder bis der Polymerfilm vollständig resuspendiert.

2. Immobilisierung von Enzymen in TBAB-Modified Nafion für Aktivitätstests

  1. Für einen trockenen Enzym, abwiegen 1-10 mg des Enzyms in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und fügen Sie 1 ml 100 mM Phosphatpuffer pH 7, eine 1-10 mg / ml Enzymlösung zu schaffen. For ein Enzym, das in Lösung ist, mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Probe 13, um die Menge des Proteins zu bestimmen, und geben eine entsprechende Menge von 100 mM Phosphatpuffer, um die Proteinkonzentration auf 1-10 mg / ml zu bringen. 1-10 mg / ml entspricht typischerweise bis 1-50 Nanomol / ml.
  2. Um 120 ul der 1 mg / ml Enzymlösung mit 60 uL des Alkylammonium-modifizierte Nafion-Lösung, und Vortex für 10 Sekunden. (Dieses Gemisch kann für eine große Anzahl von Wiederholungen skaliert werden. Halten des Enzym-zu-Polymer-Lösung Verhältnis von 2:1.)
  3. Pipette 60 pl des Enzyms / Polymer-Lösung in den Boden 3 separate 1 cm 2 Küvetten, und über Nacht trocknen lassen.

3. Assay von immobilisierter NAD-abhängigen Dehydrogenase-Enzym

  1. Um die Küvette, fügen 1,3 ml von 50 mM Natriumpyrophosphat (pH 8,8), 1,5 ml 15 mM NAD (frisch hergestellt) und 0,1 ml Wasser.
  2. Legen Sie die Küvette in einem UV / VIS Spektralphotometer (dh ThermoScientific EvolutIon 260 Bio-und Thermo Spectronic Genesys 20) zu einer Wellenlänge von 340 nm eingestellt.
  3. Null des Spektrometers, und dann 0,1 ml Ethanol. Mischen Sie die Reagenzien vorsichtig Pipettieren der Lösung auf und ab 5 mal. Für ein Leerzeichen mit 0,1 ml von zusätzlichem Wasser anstelle der 0,1 ml Ethanol.
  4. Optische Dichte bei 340 nm nach 5 Minuten, nachdem die Reagenzien in die Küvette und 20 Minuten nach zugegeben. Zeichnen Sie die zwei Datenpunkte, um eine Steigung, die für die Tätigkeit Berechnungen verwendet werden können bekommen.

4. Assay von PQQ-abhängige Dehydrogenasen

  1. Um die Küvette, fügen Sie 1,5 ml Natriumphosphat (pH 7,3) und 200 ul von 600 um PMS.
  2. Legen Sie die Küvette in einem UV / VIS Spektralphotometer, einstellbar auf eine Wellenlänge von 600 nm und dann auf Null das Spektrometer.
  3. Fügen Sie 100 ul 700 ul und 200 ul DCIP des Substrats von Interesse (Ethanol, Acetaldehyd, Glycerin, Glucose, oder Glycerinaldehyd), und mischen Sie die Reagenzien durch vorsichtiges Pipettieren der solutIonen auf und ab 5 mal. Für einen leeren, verwenden Sie 200 ul Wasser anstelle des Substrats von Interesse.
  4. Optische Dichte bei 600 nm nach 5 Minuten, nachdem die Reagenzien in die Küvette und 20 Minuten nach zugegeben.

5. Assay von immobilisierten Glucose-Oxidase

  1. Um die Küvette, 2,0 mL einer Lösung, die 0,2 M p-Hydroxybenzoesäure, 0,02% (w / v) Natriumazid, 128 U Peroxidase, 0,3 mM 4-Aminoantipyrin, 1 M Kaliumphosphat, und 50 mM Glucose. Mischen Sie die Lösung durch Auf-und Abpipettieren 5 mal.
  2. Legen Sie die Küvette in einem UV / VIS Spektralphotometer einstellbar auf eine Wellenlänge von 510 nm auf.
  3. Optische Dichte bei 510 nm nach 5 Minuten, nachdem die Reagenzien in die Küvette und wieder 20 Minuten nach zugegeben.

6. Repräsentative Ergebnisse

Die micellare Struktur des modifizierten Nafion Polymer kann durch Trocknen des ursprünglichen Salz / Polymer-Co-gegossenen Film zu fas gestörtt. 2 zeigt ein Salz / Polymer-Mischung, die getrocknet worden ist vollständig um einen transparenten, hellbraun Film. Ein Film, der zu schnell trocknet in opaken weißen Flocken von Polymeren aufgrund der Tatsache, dass die Trocknung der micellaren Struktur zu zerstören führen.

Sobald das modifizierte Nafion Polymer und Enzym gemischt worden und auf dem Boden einer Küvette zusammen gegossen, können enzymatische Aktivitäts-Assays verwendet, um die Stabilität des Enzyms in der Polymerfolie zu beurteilen. Tabellen 2-4 zeigen Testergebnisse von zwei Dehydrogenaseenzyme und Glucose-Oxidase in verschiedenen modifizierten Nafion Filme immobilisiert sind. Man beachte die höhere Aktivität der Enzyme, die gegen die Enzyme in Pufferlösung immobilisiert sind, die zeigen, dass modifizierte Polymere Nafion kann tatsächlich erhöhen die Aktivität bestimmter Enzyme (so genannte Überaktivität). Andere Enzyme haben Transport Beschränkungen auf, die spezifische Aktivität zu verringern, wenn sie bewegungsunfähig im Polymer (dh Cellulasen und Amylasen, deren Substrate sind recht groß Makromolekülen).

Quaternäres Ammoniumsalz verwendet 3-fachen Überschuss
T3A (Tetrapropylammoniumbromid) 32,37 mg / ml
TBAB (Tetrabutylammoniumbromid) 39,19 mg / ml
TPAB (Tetrapentylammoniumbromid) 46,01 mg / ml
TEHA (triethylhexylammonium Bromid) 32,37 mg / ml
TMHA (trimethylhexylammonium Bromid) 27,25 mg / ml
TMOA (trimethyloctylammonium Bromid) 30,66 mg / ml
TMDA (trimethyldecylammonium Bromid) 34,07 mg / ml
TMDDA (Trimethyldodecylammonium Bromid) 37,48 mg / ml
TMTDA (Trimethyltetradecylammoniumsalze Bromid)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium Bromid) 44,31 mg / ml
TMODA (trimethyloctadecylammonium Bromid) 47,71 mg / ml

Tabelle 1. Mengen von Tetraalkylammonium-Salze, die zum Nafion Polymer benutzt werden können.

Art der Nafion Enzymaktivität (U / g)
Buffer (kein Polymer) 16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.) 9,25 ± 2,21
TMTDA 3,23 ± 2,92
TBAB 3,93 ± 3,33
TMDDA 4,19 ± 1,04
TMOA 3,51 ± 1,11
TMDA 8,00 ± 4,53
TMHA 1,68 ± 1,39
TMHDA 4,83 ± 0,99
TMODA 10,45 ± 3,20

Tabelle 2 NAD-abhängige Glucose-Dehydrogenase-Aktivität in ausgewählten modifizierten Polymeren Nafion (Anmerkung: immobilisierte Aktivität ist eine Funktion der anfänglichen spezifischen Aktivität des Enzyms) immobilisiert..

Art der Nafion Die Enzymaktivität (mU / g)
Buffer (kein Polymer) 7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.) 70,1 ± 0,5
TMTDA 133 ± 6
TBAB 244 ± 4
TMDDA 221 ± 6
TMOA 1,78 ± 0,63
TMDA 206 ±5
TEHA 40,1 ± 50,6
TMHDA 0
TMODA 1,45 ± 0,06

Tabelle 3 PQQ-abhängige Glucose-Dehydrogenase-Aktivität in ausgewählten modifizierten Polymeren Nafion (Anmerkung: immobilisierte Aktivität ist eine Funktion der anfänglichen spezifischen Aktivität des Enzyms) immobilisiert..

Art der Nafion Enzymaktivität (U / g)
Buffer (kein Polymer) 103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.) 19,93 ± 10,10
TMTDA 247,25 ± 12,49
TBAB 152,27 ± 5,29
TMDDA 262,05 ± 6,26
TMOA 129,18 ± 2,31 TMDA 141,23 ± 1,97
TMHA 131,75 ± 2,89
TMHDA 132,50 ± 1,18
TMODA 136,50 ± 0,96

. Tabelle 4 Repräsentative Glucoseoxidase spezifische Aktivität in ausgewählten modifizierten Polymeren Nafion (: immobilisierte Aktivität ist eine Funktion der anfänglichen spezifischen Aktivität des Enzyms beachten) immobilisiert.

1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der TBAB Einbau in Nafion-Polymer und die anschließende Verwendung in Enzymimmobilisierung.

2
Abbildung 2. Optische Foto von anfänglichen Co-Gießfolien von Nafion und TBAB. Langsam trocknend liefert eine transparente, hellbraune Fettfilm über das bottom der Waagschale.

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Discussion

In der beschriebenen Verfahren werden Tetraalkylammonium-Salze eingesetzt, um kommerzielle Nafion zu modifizieren, um micellaren Polymere, die verwendet zu immobilisieren und stabilisieren Enzyme können zu schaffen. Die beschriebenen Tests in dem Verfahren zeigen, dass das Polymer verwendet werden, um eine Vielzahl von Enzymen mit einem hohen Beibehaltung der Aktivität zu immobilisieren. Wenn das interessierende Enzym hat eine sehr geringe Aktivität oder unrein ist, kann eine höhere Konzentration erforderlich sein und sollte keine Auswirkungen auf die Immobilisierung Prozess, es sei denn, Immobilisierung von Enzymen in Konzentrationen von mehr als 10 mg / ml. Die Einfachheit des Verfahrens trennt sie von anderen Enzymimmobilisierung Techniken dadurch, dass keine synthetischen Schritte (wie Polymer-Synthese oder Vernetzung) erforderlich sind. Auch diese Syntheseschritte häufig denaturieren Proteine ​​oder drastisch verringern ihre Aktivität. Die Proteinkonzentration von 1mg/ml ist lediglich ein Vorschlag für eine hohe Konzentration Enzymbeladung. Niedrigere Enzymkonzentrationen können immer eingesetzt werden,Er wird in weniger volumetrischen katalytischen Aktivität führen. In der Theorie kann eine höhere Enzymkonzentration verwendet werden, solange wie das Enzym in Lösung geht.

Da die Polymere sind löslich in niederen aliphatischen Alkoholen wie Methanol, Ethanol und Propanol, ein hoher Prozentsatz von Alkohol vorhanden sein muss, wenn das Mischen des Polymer-Suspension mit einem Enzym. In vielen Fällen ist dies kein Problem, solange das Ethanol in einer rechtzeitigen Weise verdampft wird, nachdem das Enzym-verkapselten Film gegossen wird. Jedoch kann eine Einschränkung dieser Immobilisierung auftreten, wenn ein Enzym ist überhaupt nicht Alkohol-toleranten und denaturiert oder Ausscheidungen durch die Zugabe des modifizierten Nafion Suspension. In seltenen Fällen werden Enzyme Niederschlag oder denaturieren, wenn mit dem modifizierten Nafion Suspension gemischt, in der Regel darauf hinweist, dass das Enzym denaturiert geworden und wird nicht funktionieren. Es ist möglich, den Alkohol in der Suspension zu verringern durch Resuspendieren der Polymere in Alkohol / Wasser-Mischungen, Aber niederen aliphatischen Alkoholen in signifikanten Konzentrationen (> 25%) in der Resuspensionslösung erforderlich ist, nicht so dass diese Technik nicht Immobilisierung von Enzymen / Enzymlösungen in denen es nicht diese Konzentrationen von Alkohol zu arbeiten.

Die enzymatischen Assays für jedes der Polymere mit jedem der drei Enzyme zeigen, dass die Trends in relative spezifische Aktivität gegenüber Enzym in Lösung eine Funktion des Enzyms ist. Es wird erwartet, da jedes der Enzyme ist eine andere Größe, verschiedenen pI, verschiedene optimale pH-Wert, sowie die Tatsache, dass PQQ-abhängige Glucosedehydrogenase eine Membran-assoziiertes Protein ist und benötigt daher eine sehr unterschiedliche chemische Mikroumgebung, dass cytosolischen Proteine. Deshalb gibt der hydrophob modifizierten mizellaren Nafion eine Membran-wie Umweltschutz für die Stabilisierung der aktiven PQQ-abhängige Glucose-Dehydrogenase als Puffer und zeigt, Überaktivität, die selten in immobilisierten Enzymen ist. Einnother Problem zu berücksichtigen, dass Polymermembranen Transport von großen Molekülen zu verringern und zwar Glucose (das Substrat für alle drei Tests hier dargestellt) klein ist, muss das Coenzym NAD zu diffundieren in die und aus der Membran für NAD-abhängige Dehydrogenase und dies vermindert die enzymatische Aktivität beobachtet. Insgesamt ist es wichtig zu beachten, dass die genaue Polymer für jedes Enzym zur optimiert, da die Unterschiede in Größe, Ladung, optimale pH-Wert und den Transport von Substrat / Cofaktoren für jede der Enzymsysteme werden muss.

Anders als immobilisiertes Enzym-Assays, ist die primäre Anwendung, die mit dieser Methode Enzymimmobilisierung wurde erforscht die Herstellung von enzymatischen Biosensoren und Biokraftstoff-Zellen. Wenn modifizierten Polymeren mit verkapselten Nafion Redoxenzymen auf Elektrodenoberflächen gegossen werden, können die wissenschaftlichen Fortschritte in Gegenwart geeigneter Substrate und Cofaktoren auftreten, Erzeugen eines elektrischen Stroms bzw.Onse. Bioanodes mit modifizierten Nafion fabriziert haben in Zellen, die Biokraftstoff Ethanol, Methanol, Pyruvat und Glycerin, wie in der Einleitung beschrieben nutzen verwendet worden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Autoren danken dem Office of Naval Research, United Soybean Board und der National Science Foundation für finanzielle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nafion Sigma-Aldrich 70160
Tetra alkylammonium bromide salts Sigma-Aldrich n/a
Alcohol dehydrogenase Sigma-Aldrich A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) Simga-Aldrich N7004
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich P8010
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP) Sigma-Aldrich D1878
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141
4-Hydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich 240141
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Peroxidase Sigma-Aldrich P8375
4-aminoantipyrine Sigma-Aldrich 06800
UV/Vis Spectrophotometer Thermo Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance

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References

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1 Comment

  1. Hi, Xu.
    Would you like to provide me a copy of this video.
    I promise that the video will only be used by myself, and no share on Internet.
    Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Hudan C.
    June 3, 2013 - 4:16 AM

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