La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Neuroscience

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Summary

Dans ce protocole, nous décrivons la production, la purification et le titrage des vecteurs lentiviraux. Nous donnons un exemple de transfert de gènes lentiviraux vecteur médiation dans neurones en culture primaire et les astrocytes. Nos méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres types cellulaires

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Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (63), e4031, doi:10.3791/4031 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Emballage de vecteurs lentiviraux

Les vecteurs lentiviraux sont produites par co-transfection d'un vecteur lentiviral de transfert et d'autres plasmides requis pour l'emballage dans des cellules 293T par la méthode de transfection au phosphate de calcium. Nous utilisons 10 100-mm boîtes de culture tissulaire dans ce protocole. Il peut être agrandie ou réduite en fonction des applications. La lignée cellulaire 293T est maintenue dans un milieu de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) avec du glucose à haute (4500 mg / L), supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2.

  1. Semences 293T cellules à confluence de 30-40% à 10 100 mm boîtes de culture tissulaire (3 x 10 6 cellules / boîte) dans un milieu de culture. Retour des cellules de l'incubateur.
  2. Après 20-24 h de culture, vérifier la densité cellulaire. Les cellules doit être d'environ 80% de confluence au moment de la transfection.
  3. Préparer un tube de 50 ml. Ajouter 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris-HCl, 0,1 mML'EDTA, pH 7,9) moins le volume total de l'ADN plasmidique suivant. Ajouter 100 ug transfert lentiviral plasmide (figure 1), 58 mg pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-G, 25 ug pRSV-Rev, 600 pi 2M CaCl 2. Mélanger délicatement.
  4. Préparer un autre tube de 50 ml. Ajouter 5 ml 2x HBS (0,05 M de HEPES, 0,28 M de NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,12).
  5. Prenez l'ADN-CaCl 2 par mélange de 10 ml pipette et ajouter dans le tube contenant 2 x HBS, goutte à goutte tout en vortex le tube.
  6. Gardez la réaction de précipitation à la température ambiante (RT) pendant 30 min.
  7. Retirer les boîtes de culture de pépinière. Mélanger la réaction de précipitation et par vortex. Ajouter 1 ml de suspension à chacune des cellules plat de 100 mm contenant. La suspension doit être ajouté lentement, goutte à goutte tout en remuant doucement le support dans le plat. Retour de ces plats à l'incubateur et laisser reposer pendant 5 h.
  8. Retirer le milieu de la culture. Ajouter 6 ml milieu de culture frais contenant 6 mM de sodium butyrate à chaque plat. Retour aux cultures de l'incubateur. Après une nuit de culture, s'il ya un rapporteur fluorescent dans la construction, vérifier l'expression du gène rapporteur sous microscope à fluorescence. Habituellement, plus de 80% des cellules expriment le gène rapporteur si elle est entraînée par un promoteur ubiquiste (par exemple promoteur CMV).
  9. Deux jours (40-44 h) après la transfection, ramasser le surnageant à partir de 10 plats en 2 tubes de 50 ml (environ 30 ml dans chaque tube). Congeler le surnageant dans congélateur à -80 ° C ou aller à l'étape suivante.

2. La concentration et la purification des vecteurs

  1. Centrifuger le fraîchement prélevé ou décongelés surnageant à 900 g (environ 2000 tours par minute) pendant 10 min pour enlever tous les débris de cellules dans le surnageant.
  2. Fixer une seringue de 60 ml, à un filtre de 0,2 um-SFCA seringue. Transférer surnageant de 50 ml tube de la seringue. Filtrer le surnageant dans un tube à centrifuger polyallomère.
  3. Prenez 5 ml de saccharose à 20% (préparé dans du PBS) dans une pipette de 5 ml. Insérerla pipette à la partie inférieure du tube de centrifugeuse contenant surnageant. Ajouter lentement la solution de saccharose dans le surnageant vecteur. Répétez ces étapes pour surnageant d'un autre tube.
  4. Centrifuger le surnageant à 11000 rpm et 4 ° C pendant 4 h avec rotor Beckman SW28 balançoire.
  5. Eliminer le surnageant. Ajouter 150 ul Lactose 4% (préparé dans du PBS) à chaque tube de la centrifugeuse. Remettre en suspension les culots.
  6. Transfert du vecteur concentré de tous les tubes à centrifuger dans un tube de 1,5 ml. Laisser le tube sur la glace pendant 15 min.
  7. Mélanger la suspension vecteur par pipetage. Spin avec microcentrifugeuse à pleine vitesse (environ 16000 g) pendant 1 min.
  8. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Divisez l'échantillon final en 20 aliquotes et les a entreposés dans congélateur à -80 ° C.

3. Le titrage des Vecteurs

  1. Graine 5 x 10 4 / puits de cellules HT1080 12 à plaque de puits dans 1 ml du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
  2. Après overnigla culture ht, compter les cellules d'un puits et marquer le nombre de cellules.
  3. Faire 5 fois de dilution en série (1:5, 1: 25; 1:125, et 1:625) du vecteur concentrée avec du milieu de culture. Ajouter I ul de chaque vecteur dilués dans les puits séparés. Les échantillons peuvent être dupliquées pour augmenter la précision.
  4. Ajouter une pi 4 mg / ml polybrène (bromure d'hexadiméthrine) dans chaque vecteur de puits contenant et dans un puits sans vecteur. Mélanger en secouant doucement la plaque. Retour à l'incubateur pendant 48 h.
  5. Evacuer le milieu des puits de culture cellulaire. Laver chaque puits avec du PBS. Ajouter 250 pi 1x trypsine-EDTA solution aux cellules. Lorsque les cellules se détachent (3-5 min), ajouter 1 ml milieu de culture. Remettre en suspension les cellules par pipetage. Transfert suspension cellulaire à 1,5 ml tubes à centrifuger.
  6. Centrifuger à 900 g pendant 6 min. Pour les vecteurs avec un gène rapporteur fluorescent (par exemple GFP), passez à l'étape 3.7 pour l'analyse FACS. Pour les vecteurs sans un journaliste, passez à l'étape 3.8 pour qPCR en temps réel.
  7. Pour les vecteurs contenant un fluogène rapporteur fluorescentes, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 300 ul de 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Déterminer le pourcentage des cellules rapporteur positifs par analyse par FACS. Le titre sera représenté sous forme d'unités de transduction par millilitre concentrée vecteur (TU / ml).

L'équation 1

Par exemple, si 1 x 10 5 cellules a été transduites avec pl 1/25 (0,04 pi) du vecteur et les cellules de 30% sont positifs journaliste, le titre sera:

L'équation 2

N'utilisez que les dilutions tomber dans une relation linéaire entre le pourcentage de cellules positives et la quantité de vecteur ajoutée pour calculer le titre. Le titre final doit être une moyenne des titres obtenus à partir de transductions d'au moins 2 montants différents du vecteur.

  1. Pour les vecteurs sansgène rapporteur fluorescent, extraire l'ADN génomique de cellules HT1080 en utilisant QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) selon le protocole du fabricant. Amplifier la séquence du vecteur dans l'ADN génomique en utilisant ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) avec des amorces (en matière de VIH-1 PBS / psi région 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'et 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', et la sonde TaqMan 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Gène de l'albumine qui est un gène à copie unique dans le génome (2 copies par cellule) a également été amplifiée avec les amorces 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'et 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', et la sonde 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 «comme un contrôle interne. Déterminer les nombres de copies du vecteur et de l'albumine par PCR dans la plaque de 96 puits selon l'instruction de la fabrication avec le programme suivant: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, et 35 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 2 min. Dix-dilutions de plasmides de concentration connue (représenté sous forme de copienombre) contenant les séquences de matrice doit également être amplifié pour créer une courbe d'étalonnage pour la quantification des échantillons inconnus. Le titre sera représenté sous forme d'unités d'intégration par millilitre concentrée vecteur (UI / ml).

L'équation 3

4. La transduction de cultures néocorticaux

Cultures néocorticaux contenant à la fois les neurones et les cellules gliales sont préparés à partir de cortex de souris en utilisant un procédé de revêtement en deux étapes, comme décrit précédemment 18. Neocortices obtenus à partir de souris fœtales à 14-16 jours de gestation sont étalées sur une monocouche précédemment établi gliales dans du MEM supplémenté avec 10% de FBS, 20 mM de glucose et 2 mM de glutamine de 24 puits plaque de culture tissulaire.

  1. Après 5 jours in vitro, ajouter 10 uM cytosine arabinoside (Ara-C) dans la CENALla culture ortical pour inhiber la division cellulaire non-neuronales. Continuer la culture des cellules pendant 2 jours.
  2. Milieu de culture chaud à 37 ° C bain-marie pendant 5-10 min. Remplacer l'Ara-C contenant un milieu de milieu de culture frais (500 pl / puits).
  3. Ajouter vecteur avec désirée IAM (multiplicité d'infection, le rapport du nombre de particules de vecteur au nombre de cellules cibles) à la culture. Continuer la culture pendant 24 h. Nous utilisons MOI de 1-10 (généralement 5) dans des cultures primaires corticales.
  4. Remplacez le milieu de culture par du milieu frais. Continuer la culture. Si il ya un gène rapporteur dans la construction de vecteur, vérifiez les cellules sous un éclairage fluorescent microscope 2 jours après transduction. Expression du gène rapporteur est visible dans les neurones 2-7 après transduction, en fonction de la conception du vecteur et la dose utilisée.

5. Les résultats représentatifs

Les titres de vecteurs lentiviraux produites avec cette gamme protocole 10 8 -10 10 UI / ml, WHICh sont adaptés pour la transduction d'une variété de types de cellules du SNC à la fois in vitro et in vivo. tableau 1 et figure 2 montrent un résultat représentatif en utilisant les vecteurs produits par ce protocole. Nous transduites murins cultures néocorticales avec des vecteurs lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte (GFP), contrôlée par synapsine (SYN) promoteur ou gliale la protéine acide fibrillaire (GFAP) promoteur. Sept jours après transduction, nous avons effectué immunomarquage pour les neurones et les astrocytes étiquettes avec des anticorps anti-neun et anti-GFAP, respectivement. Comme le montre le tableau 1 et fig. 2A, après transduction avec le vecteur portant le promoteur synapsine, plus de 90% des neurones (cellules + de Neun) expriment la GFP et aucun astrocytes (GFAP + cellules) exprimer ce gène rapporteur. Lorsque le promoteur GFAP est utilisé dans la construction du vecteur (figure 2B), environ 80% des astrocytes (GFAP + cellules) expressions GFP; tous les cellules GFP + sont les astrocytes comme l'a confirmé par colocalisation avec la GFAP et l'absence d'expression de la GFP dans les cellules NeuN-étiquetés. Ces résultats démontrent que les vecteurs lentiviraux sont très efficaces pour fournir des transgènes à des cellules de CNS et de l'expression génique des cellules spécifiques peuvent être obtenus lorsque les promoteurs appropriés sont utilisés.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique du VIH à base de vecteurs lentiviraux et les plasmides d'emballage. Le provirus VIH-1 est affiché en haut. Les éléments de production de vecteur sont séparés en quatre différents plasmides. Le transfert lentivirale plasmide contient un hybride 5 'LTR dans lequel la région U3 est remplacé par le cytomégalovirus (CMV), le signal d'encapsidation (ψ), la séquence RRE, le tube polypurique centrale (cPPT), un gène d'intérêt (par exemple une rapporteur fluorescent) le long d'un promoteur de choix, et l'extrémité 3 'LTR dans lequel leséquences cis réglementaires sont complètement retirés de la région U3. pMDLg / pRRE contient les gènes gag et pol et RRE séquence de VIH-1 sous le contrôle du promoteur CMV. pRSV-Ap contient la séquence codante de Rev dirigée par le promoteur RSV. pCMV-G contient le gène de protéine VSV-G sous le contrôle du promoteur CMV. PA indique que le signal de polyadénylation de l'homme β-globine.

Figure 2
Figure 2. Expression de gènes rapporteurs dans la souris culture mixte néocorticale transduits avec des vecteurs lentiviraux porteurs de cellules spécifiques au type de promoteurs. Les cultures ont été transduites avec LV-SYN-GFP (A) ou LV-GFAP-GFP vecteurs (B) à une MOI de 5. Sept jours après transduction, les cellules ont été immunomarquées avec anticorps anti-NeuN ou anti-GFAP. Panneaux supérieurs montrent fluorescence de la GFP, les panneaux du milieu montrent immunocoloration et panneaux inférieurs sont fusionnés images (GFP: vert; NeuN ou GFAP: rouge). Vecteur Cellules GFP + dans les neurones + GFP dans les astrocytes LV-SYN-GFP 92,2 ± 7,3 0 LV-GFAP-GFP 0 78,3 ± 11,5

Tableau 1. Comparaison de l'expression de la GFP dans murins cultures néocorticales transduits avec des vecteurs lentiviraux portant des promoteurs différents: a.
quelques cultures néocorticales murins (5 x 10 5 / puits dans 24 puits) ont été transduites avec le LV-SYN-GFP ou LV-GFAP-GFP à une MOI de 5. Sept jours après transduction, les cultures ont été fixées et immunocolorées pour NeuN ou GFAP. Le nombre de cellules GFP et NeuN / GFAP exprimant ont été comptés dans les images à partir de 10 champs par condition expérimentale. Les valeurs représentent le pourcentage de neurones (cellules + de Neun) ouastrocytes (GFAP + cellules) qui ont également exprimé le gène rapporteur GFP. Les valeurs indiquées sont des moyennes ± SD de trois expériences indépendantes.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons montré la production de vecteurs lentiviraux et l'application de ces vecteurs dans les cultures néocorticales. Nous avons démontré l'efficacité et de la cellule spécifique au type de transduction par les vecteurs produits par ces méthodes. Lorsque le promoteur synapsine est utilisé, expression de la GFP est strictement neurone spécifique. Lorsque le promoteur GFAP est utilisé, expression de la GFP est exclusivement dans les astrocytes. Si aucune cellule spécifique au type d'expression est nécessaire, un promoteur ubiquitaire peut être utilisé. Nous avons trouvé à la fois ubiqutin et la phosphoglycérate kinase (PGK) promoteurs peuvent conduire à haute expression des gènes dans les cultures au niveau du néocortex 6. L'expression des gènes conduit par des vecteurs lentiviraux peuvent être personnalisés pour des niveaux spécifiques de types d'expression ou de la cellule par le choix des promoteurs (par exemple, omniprésente ou le type cellulaire spécifique) ou en utilisant différentes protéines de l'enveloppe ou pseudotypes vecteur pour cibler des tissus ou des applications spécifiques. Par exemple, avec la protéine G pseudotypage la rage ou une fusion de VSV-G uned la rage protéines soutient transport axonal rétrograde 19,20. Le protocole de transfection transitoire permet emballage vecteur avec des protéines d'enveloppe différents.

Les vecteurs lentiviraux sont généralement concentrés par ultracentrifugation sans étapes de purification. Ces vecteurs non purifiés sont adaptés à de nombreux types cellulaires. Toutefois, des cultures primaires de neurones sont sensibles aux contaminants de cellules productrices, ce qui entraîne dans le lot à la variation des lots pour la cytotoxicité. L'étape de saccharose à 20% coussin purification permet aux vecteurs systématiquement non toxique dans les neurones primaires. Nous vous recommandons d'utiliser des vecteurs purifiés pour la transduction de neurones primaires et l'injection dans les animaux. Si plus grande échelle ou supérieur pureté de préparations de vecteur sont nécessaires, d'autres techniques de purification, comme la chromatographie d'affinité et d'échange d'anions 21 membrane chromatographie 22 peut être utilisée. Comme à long terme de transduction est généralement requis dans des cultures primaires de neurones, Des précautions particulières doivent être prises pour minimiser la contamination lors de la préparation des vecteurs. En passant le surnageant vecteur avec filtre de 0,2 uM et en utilisant des tubes à centrifuger autoclavables polyallomère lors de la concentration du vecteur servira à cette fin. Bouteille-top filtres peuvent être utilisés si un grand volume de surnageant doit être filtrée. Le butyrate de sodium a été signalé pour stimuler l'activité des promoteurs 23. Addition de butyrate de sodium au milieu de culture après la transfection des cellules productrices peut augmenter le titre plus de 10 vecteur plis 24. Polybrene (hexadiméthrine bromure de méthyle) a été largement utilisé pour les protocoles de transfert de gènes pour augmenter l'efficacité du transfert de gène rétroviral en neutralisant les charges négatives, ce qui facilite l'interaction vecteur-cellule 25. Dans nos mains, polybrène est toxique pour les neurones dans les cultures néocorticales. Par conséquent, polybrène devrait être évitée dans la transduction des cultures primaires de neurones. Si il n'y aun journaliste fluorescent dans le vecteur, il est commode de déterminer le titre vecteur par analyse par FACS. Lorsque aucun rapporteur est disponible ou un gène rapporteur est entraîné par un tissu promoteur, qPCR spécifique destiné à détecter l'intégration du vecteur dans des cellules cibles doit être un meilleur choix que l'intégration du vecteur est indépendante de l'expression du transgène. Le titre de vecteurs spécifiques déterminées par analyse par FACS sera inférieure à celle de qPCR que tous les exemplaires intégrés du vecteur sont fonctionnels. Titres Vecteur peut également être déterminée par la mesure de la protéine p24 du VIH par ELESA ou génomique vecteur ARN par qRT-PCR dans les préparations de vecteurs. Cependant, ces méthodes sont moins précises en raison du nombre important de particules virales défectives inévitablement générés au cours du processus d'emballage et les particules fonctionnelles qui ne réussissent pas à transduire des cellules cibles 26. Les vecteurs faites par le présent protocole ont été utilisées avec succès dans les deux in vitro et in vivo chez rodent du cerveau 27. Les enquêteurs devraient tester dans leurs systèmes individuellement, en tant que vecteur médiée par l'expression des gènes n'est pas nécessairement identique dans les cultures cellulaires et in vivo, même dans le même type de cellule 6,28. Des vecteurs lentiviraux ont été largement utilisés pour la surexpression ou abattre des gènes d'intérêt dans une variété de types de cellules dans le SNC. Notre protocole devrait être utile pour les enquêteurs en neurosciences de développer des vecteurs lentiviraux dans leurs applications de recherche.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH Neuroscience Blueprint subvention de base (P30 NS057105, BJS) à l'Université de Washington, le Programme de subvention de projet NS032636 (BJS) et par le Centre de l'espoir pour les troubles neurologiques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
MEM Invitrogen 11090-081
Fetal bovine serum Hyclone SV3001403
PBS Mediatech, Inc. 21-040-CM
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T3924
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
293T cells ATCC CRL-11268
HT1080 cells ATCC CCL-121
Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish BD Biosciences 353003
1 x 3 ½ in polyallom–r centrifuge tube Beckman Coulter Inc. 326823
0.2-micron syringe filter Corning 431219
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304

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References

  1. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  2. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
  3. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
  4. Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
  5. Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
  6. Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
  7. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
  8. Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
  9. Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
  10. Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
  11. Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
  12. Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
  13. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
  14. Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
  15. Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
  17. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
  18. Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
  19. Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
  20. Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
  21. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  22. Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
  23. Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
  24. Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
  25. Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
  26. Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
  27. Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
  28. Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).

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