Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Published 5/21/2012
5 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Cite this Article

Copy Citation

Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040, doi:10.3791/4040 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Binnen de darm verblijven, unieke populaties van aangeboren en adaptieve immuuncellen die betrokken zijn bij het ​​bevorderen van tolerantie ten opzichte van commensale flora en voedsel antigenen, terwijl gelijktijdig de resterende klaar om ontstekingsreacties te monteren in de richting van invasieve pathogenen 1,2. Antigeen presenterende cellen, in het bijzonder DCs en macrofagen, spelen een cruciale rol bij het ​​handhaven van intestinale immuun homeostase via hun vermogen om betekenis en adequaat te reageren op de microbiota 3-14. Efficiënte isolatie van intestinale DCs en macrofagen is een cruciale stap in het karakteriseren van het fenotype en functie van deze cellen. Hoewel veel effectieve methoden voor het isoleren intestinale immuuncellen, zoals DCs en macrofagen, zijn beschreven 6,10,15-24 veel vertrouwen op lange digesties maal negatief kan beïnvloeden cel oppervlakte antigen expressie levensvatbaarheid van de cellen en / of cel opbrengst. Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van grote aantallen viable-, darm-DCs en macrofagen. Fenotypische karakterisatie van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd door het rechtstreeks kleuring geïsoleerde darmcellen met fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen voor meerkleuren flowcytometrie. Bovendien zijn zeer zuiver DC populaties en macrofaag geïsoleerd functionele onderzoeken waarin CD11c en CD11b magnetische geactiveerde celsortering kralen gevolgd door celsortering.

Protocol

1. Dissectie en Dissociatie van darmepitheelcellen

Voorbereiding van de reagentia en apparatuur:

  • Warm Ca2 + / Mg2 +-vrij PBS (CMF PBS) tot kamertemperatuur.
  • Warm Ca2 + / Mg2 +-vrij HBSS met 5% FBS (CMF HBSS / FBS) en 2 mM EDTA tot kamertemperatuur.
  • Warm Orbital Shaker tot 37 ° C.

Opmerking: Stap 1,1 tot 1,7 worden uitgevoerd zo snel mogelijk de mate van celdood te minimaliseren en om een maximale cel opbrengst.

  1. Euthanaseren muizen in een CO 2 kamer en spuit 70% ethanol op de buik en thorax.
  2. Maak een kleine horizontale incisie in het midden van de buik met een schaar en pel de huid terug naar het buikvlies bloot te leggen.
  3. Ga naar de maag te scheiden van de bovenste dunne darm door te snijden in de pyloric sluitspier. Tease weg het mesenterium met een pincet en snijd opnieuw bijde ileo-cecal klep om de gehele dunne darm te bevrijden van de dikke darm. Maak een snede in de anus en weer plagen elkaar het mesenterium tot de dikke darm is gratis.
  4. Snijd de dikke darm lengterichting met een schaar en afwassen fecale inhoud en slijm uit het darmlumen in CMF PBS bij kamertemperatuur.
  5. Gebruik een schaar en tang om macroscopisch ontleden van de plaques van Peyer langs de anti-mesenteriale oppervlak van de dunne darm en opengesneden de dunne darm lengterichting.
  6. Was de dunne darm lumen die ontlasting en slijm in CMF PBS bij kamertemperatuur.
  7. Afzonderlijk snijd de kleine / dikke darm in ongeveer 1,5 cm stukjes en doe ze in aparte 50 ml conische buizen met 30 ml van de voorverwarmde CMF HBSS / FBS en 2 mM EDTA. Voeg niet meer dan 1 darm per 50 ml conische buis.
  8. Horizontale positie elk 50 ml conische buis in een orbitale schudder en schudden bij 250 rpm gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </ Li>
  9. Plaats een gaas zeef boven een afvalbak emmer en giet de inhoud van elk 50 ml conische buis tot en met het 1,5 cm stukjes darm te herstellen en plaats ze in aparte 50 ml conische buizen met 30 ml van de voorverwarmde CHBSS / FBS met 2 mM EDTA.
  10. Herhaal 1.8.

2. Tissue Spijsvertering en isolatie van darmcellen

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

  • Collagenase oplossing: 1,5 mg / ml Type VIII Collagenase opgelost in voorverwarmde CMF HBSS / FBS met 40 ug / ml DNase I
  • Voorverwarmde CMF HBSS / FBS en 2 mM EDTA.
  • Voorverwarmde orbitale schudder bij 37 ° C.
  • IJskoude CMF HBSS / FBS.
  1. Na de tweede ronde van schudden, giet de inhoud van elk 50 ml conische buis door de zeef en over te dragen 1,5 cm stukjes darm naar een klein plastic wegen boot na deppen overtollige media met behulp van een papieren handdoek.
  2. Snel gehakt van de 10,5 cm stukjes darm met een schaar direct in het gewicht van de boot en voeg gehakt darm tot 20 ml collagenase oplossing. Horizontaal te plaatsen elk 50 ml conische buis in een orbitale schudder en Digest bij 200 rpm gedurende 10-20 minuten bij 37 ° C. Zie discussie hieronder over optimalisatie.
  3. Kort vortex grondig dissociatie van het resterende darmweefsel en filter zorgen door een 100 um zeef cel direct in een 50 ml conische buis.
  4. Top off elke 50 ml conische buis met CMF HBSS / FBS en centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Indien een vaste pellet niet waargenomen colon monsters na centrifugeren moeten de monsters opnieuw gecentrifugeerd gedurende 3,5 min. Herhaal wasstap weer.
  5. Giet het supernatant en resuspendeer de celpellet in ijskoud CMF HBSS / FBS en plaats monsters op ijs.
  6. Ga verder met sectie 3 voor FACS verwerving / analyse of Sectie 4 voor magnetische-kraal verrijking voor high-speed cell Sorting.

3. Antilichaam kleuring voor Multi-Color Flowcytometrische analyse van DCs en macrofagen

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

  • IJskoude CMF PBS.
  • Ice-koude vlekken buffer (CMF PBS + 5% FBS).
  • Bereid dode cel vlek in ijskoud CMF PBS bij 1:1000 verdunning met Live / Dead Muur Aqua Dead Cell Stain Kit.
  • Bereid het antilichaam kleuring cocktail door het toevoegen van de volgende fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen (mAb's) om de ijskoude vlekken buffer: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
  1. Breng cellen in een 5 ml polystyreen rondbodemkolf (FACS) buis.
  2. Twee keer wassen cellen in ijskoude CMF PBS.
  3. Incubate monsters met dode cel kleuring gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
  4. Twee keer wassen cellen in ijskoude CMF PBS.
  5. Blok cellen met 2.4G2 anti-FcγRIII/II in ijskoud vlekkenbuffer gedurende 10 min op ijs.
  6. Was de cellen in ijskoude vlekken buffer.
  7. Incubeer de monsters met een antilichaam kleuring cocktail voor 20 min op ijs in het donker.
  8. Was de cellen met ijskoude vlekken buffer twee keer en opnieuw in suspensie monsters in 400 ul ijskoude vlekken buffer en passeren 40 urn filter dop op FACS buizen.
  9. Verwerven van samples op LSR II cytometer (BD) zoals gedefinieerd door gating strategie van punt 5 en figuur 1.

4. Verrijking van DCs en macrofagen uit de darm

De voorbereidingen van de reagentia en apparatuur:

  • Ice-koude vlekken buffer (CMF PBS + 5% FBS).
  1. Incubeer enkele celsuspensie verkregen uit stap 2.5 met CD11b en CD11c MACS kralen volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Was cellen met ijskoude buffer kleuring gevolgd door centrifugatie.
  3. Gooi supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml ijskoude vlekken bufferen passeren een 100 um zeef cel, gevolgd door een 40 urn cel zeef.
  4. Verrijk voor magnetische kraal-aangehechte cellen door positieve selectie met MACS LS magnetische kolom.
  5. Herhaal stap 4.2 en gooi supernatant.
  6. Incubeer de cellen met een oppervlakte marker mAb's zoals beschreven in stap 3.7.
  7. Twee keer wassen magnetische kraal verrijkte cellen met ijskoude vlekken buffer. Resuspenderen celpellets in 500 pL ijskoude vlekken buffer zonder natriumazide, en passeren 40 urn cel zeef in een FACS buis.
  8. Ga verder met FACS-sortering van de BD ARIA II Cell Sorter voor intestinale DC en / of macrofagen subsets van belang te sorteren.

5. Gating-strategie voor LP APC's

Let op: Houd er rekening mee dat de ongekleurde intestinale cellen kunnen worden gebruikt als een negatieve controle om te helpen bij de juiste plaatsing van de poorten naar positieve en negatieve populaties te scheiden.

  1. Zoals in figuur1, een dot plot en zijn inclusief alle cellen die positief zijn voor de doden cel vlek (Fig. 1A), gevolgd door de uitsluiting van doublet evenementen (afb. 1B en C). Dan hek aan de cellen van belang op basis van vooruit en zijwaartse verstrooiing en zorg ervoor dat vuil uit te sluiten (fig. 1D).
  2. Maak nog een dot plot en verder hek aan CD45 + en IA b + cellen, die fenotypisch kenmerkt APC's (fig. 1E).
  3. Op een aparte dot plot, analyseren CD11b en CD11c expressie van specifieke DC en macrofaag subsets (R1, R2, en R3.; Figuur 1F) te onderscheiden. Cellen van R1 zijn CD11c + CD11b saai / - cellen. De regio, R2, wordt afgebakend, zodanig dat deze cellen een vergelijkbaar niveau van oppervlakte-expressie hebben voor CD11c als in de cellen van R1, maar cellen van R2 ook de expliciete CD11b. Daarna wordt de R3 regio is voor cellen die CD11b + en CD11c dof / -.
  4. Eenalyze regio's R1, R2, R3 en verder voor F4/80 en CD103 expressie macrofagen en DC populaties te onderscheiden, respectievelijk. De CD11c + CD11b saai / - cellen van R1 hebben hoge niveaus van de αE integrine, CD103 en een laag gehalte van F4/80 (fig. 1G). CD11b + CD11c + cellen van R2 zijn samengesteld uit zowel de DC's en macrofagen op basis van hun dichotome expressie van CD103 en F4/80 (fig. 1H). Ten slotte, CD11b + CD11c saai / - cellen van R3 vormen macrofagen op basis van de fenotypische profiel van F4/80 + en CD103 - (Fig. 1I) 16.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1
Figuur 1. Gating strategie voor intestinale DCs en macrofagen. Dead cellen (A) en doubletten (B en C) werd eerst uit de analyse en kleine darminterne cellen waren gated dienovereenkomstig door te sturen en zijwaartse verstrooiing (D) en APC's werden gedefinieerd als CD45 + IA b + (E). Macrofagen en DC's werden geïdentificeerd door de expressie van CD11b en CD11c (F). CD103 en F4/80 uitdrukking voor cellen pre-gated op R1 (G), R2 (H) en R3 (I) populaties werd geanalyseerd.

Figuur 2
Figuur 2. Cel opbrengst en antilichaam vlekken kwaliteit hangt af van de spijsvertering tijd. CD11b en CD11c kleuringspatroon en de totale opbrengst van de cel onder-(A, D), optimaal-(B, E) of over-verteerd (C, F) darmweefsel.

Intestinale cellen werden geïsoleerd uit een C57BL / 6 muis dunne darm en DCs en macrofagen werden geanalyseerd door FACS op BD LSR II. Spanning en compensatie werden ingesteld met behulp van ongekleurde en single fluorochroom-gekleurde splenocyten. Dode cellen (Fig. 1A) en doubletten (Fig. 1B en C) werd eerst uitgeslotende analyse. Cellen van belang werden vervolgens geanalyseerd op basis van vooruit en zijwaartse verstrooiing (fig. 1D), gevolgd door gating op CD45 + en IA b + cellen (fig. 1E). Daarna CD11b en CD11c expressie werd gemeten onder de CD45 + IA b + cellen drie gebieden (R1, R2 en R3.; Figuur 1F) af te bakenen. CD103 en F4/80 uitdrukking in de drie regio's werd geëvalueerd om onderscheid te maken tussen DC's en macrofagen, respectievelijk. De CD11c + CD11b saai / - cellen van R1 uitgedrukt hoge niveaus van de αE integrine, CD103 en een laag gehalte van F4/80 (fig. 1G). CD11b + CD11c + cellen van R2 waren samengesteld uit zowel de DC's en macrofagen op basis van hun dichotome expressie van CD103 en F4/80 (fig. 1H), terwijl CD11b + CD11c saai / - cellen van R3 vormen macrofagen op basis van de fenotypische profiel van F4 / 80 + en CD103 - ( 16. Macrofagen in de R2-poort en macrofagen in de R3 poort hebben dezelfde voor-en zijwaartse verstrooiing eigenschappen en zijn te onderscheiden door CD11c expressie. De functionele tweedeling van deze subsets nog niet volledig begrepen.

De verhouding tussen de duur van weefsel afbraak van de totale opbrengst cel en de expressie van CD11b en CD11c is weergegeven in figuur 2. Darmweefsel dat was geknipt 3 min (onder-digestie) leverde lage totale aantal cellen (Fig. 2D) en dus weinig DCs en macrofagen voor karakterisering (Fig. 2A). Weefsel spijsvertering voor 11 minuten produceerde een robuuste opbrengst van levende cellen (fig. 2E) met een bevolking van DCs en macrofagen dat hoge niveaus van CD11b en CD11c uitgedrukt en waren fenotypisch verschillende (figuur 2C). Daarentegen destructie 50 min (over-digestie) resulteerde in een soortgelijke cel als opbrengst compared geoptimaliseerde digestie (Fig. 2E en F), maar afbakening van verschillende celpopulaties met CD11b en CD11c werd onbekende de expressie van CD11c verminderde (Fig. 2C) en het aantal dode cellen verhoogd (data niet getoond).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Figuur 3
Figuur 3. Factoren die belangrijk zijn voor het optimaliseren van cel-opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie. Cell opbrengst en oppervlakte-antigeen expressie worden rechtstreeks beïnvloed door de duur van weefsel de spijsvertering, de specifieke kenmerken van de collagenase, de mate van weefsel hakken, en de aanwezigheid of afwezigheid van ontsteking, die van invloed kunnen weefsel integriteit en cellulariteit. Langdurige weefsel afbraak kan een verminderde levensvatbaarheid van de cellen en oppervlakte antigen expressie terwijl onvoldoende weefsel afbraak kan leiden tot een gebrek aan cellen analyse.

Hier hebben we gedetailleerd een methode voor de snelle isolatie van de muis intestinale DCs en macrofagen voor fenotypische karakterisering met behulp van multi-color flow cytometrie en voor verrijking met behulp van MACS kralen en cel sortering tot functionele studies uit te voeren op gezuiverde cellen. Het optimaliseren van de concentratie van collagenaseen de duur van weefsel afbraak moet een robuuste celopbrengst produceren zonder levensvatbaarheid en oppervlakte antigen expressie. Onder-digestie levert een lage totale aantal cellen en een gebrek van DCs en macrofagen voor het karakteriseren (Fig. 2A en D). Anderzijds, over-digestie levert een totale aantal cellen vergelijkbaar geoptimaliseerde condities (fig. 2F), maar het aantal dode cellen aanzienlijk verhoogd (gegevens niet getoond) en de kwaliteit van de kleuring wordt aangetast. Net als onder-vergisting, zou de over-vergisting van weefsel compliceren fenotypische karakterisering en zuivering.

Een aantal extra parameters, welke het gebruik van dit protocol zijn de fabrikant, het type en specifieke partij van collagenase, de integriteit en de celeigenschappen van de darm, en de mate van weefsel wordt gehakt. Als variatie in collagenase-activiteit kunnen bestaan ​​tussen verschillende fabrikanten, soorten collagenase, en de productie Lots, de sterkte van de spijsvertering kan sterk variëren en vereist optimalisatie. Vandaar dat de selectie van de meest geschikte vorm van collagenase is van cruciaal belang bij het ontwerpen van een experiment als de kwaliteit en de reproduceerbaarheid van de gegevens kan worden beïnvloed. In onze ervaring, collagenase type VIII verkregen van Sigma-Aldrich heeft de beste resultaten met dien verstande echter hebben we ook succes gehad met collagenase type IV van Sigma-Aldrich.

Hoewel de hierboven genoemde protocol is geoptimaliseerd voor gezonde kleine en grote darmen, kan met succes worden toegepast voor de isolatie van DCs en macrofagen ontstoken weefsel vertonen verhoogde cellulariteit en bouwkundige vervorming geassocieerd met ontsteking. De aanwezigheid van intestinale ontsteking kan dramatisch effect op de snelheid van de spijsvertering-vaak het verhogen van de gevoeligheid van het darmweefsel bij de actie van proteolytische enzymen op basis van onze ervaring. Daarom de vertering of concentration van collagenase moet worden aangepast aan veranderingen in weefselintegriteit geassocieerd met ontsteking.

Bovendien zal de mate van hakken het weefsel invloed op de duur van weefsel spijsvertering. Hakken het weefsel in kleinere stukken verhoogt de oppervlakte voor de spijsvertering en geeft meer cellen, maar voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, omdat het weefsel kunnen gevoeliger zijn om over-vergisting. Bijgevolg kan de vertering moeten worden verlaagd. Daarentegen zal een slechte hakken leiden tot een grotere stukjes weefsel die zal verteren slecht wat resulteert in een laag totaal cel opbrengst. Verhoging de vertering kan voor gebrek hakken zekere mate.

Bij optimalisatie van de parameters voor darmweefsel digestie met collagenase, een robuuste celopbrengst snel gebeuren. Hierdoor kan intestinale DC populaties en macrofaag beter worden gekarakteriseerd en gezuiverd voor functionele studies cytokine beoordelenproductie, antigeen presentatie, en de regulering van immuuncellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Wij danken Aaron Rae (Emory University Department of Pediatrics en de Children's Healthcare van Atlanta Flow Core) voor celsortering. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​AA01787001, een Career Development Award van de Crohn en Colitis Foundation of America, en een Emory-Egleston Children's Research Center zaad subsidie ​​TLD

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free
Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red Fisher Scientific SH3001603
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza Inc. 17-737E
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H Heat-inactivated
0.5M EDTA (pH 8.0) Cellgro 46-034-CI
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C2139
DNase I Roche Group 14785000 Stock solution: 100mg/ml
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation Invitrogen L34957 Use at 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11) BD Biosciences 557235 Use at 1:100
CD103-PE mAb (M290) BD Biosciences 557495 Use at 1:100
FcγRIII/II mAb (2.4G2) BD Biosciences 553141 Use at 1:200
CD11c-APC mAb (N418) eBioscience 17-0114-82 Use at 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb eBioscience 56-5321-82 Use at 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) eBioscience 48-0112-82 Use at 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) eBioscience 25-4801-82
CD11b microbeads Miltenyi Biotec 130-049-601
CD11c microbeads Miltenyi Biotec 130-052-001
50 mL conical tubes BD Biosciences 352098
Single mesh wire strainer Chefmate
Small weigh boat Fisher Scientific 08-732-116
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
40 μm cell strainer BD Biosciences 352340
5 mL polystyrene round-bottom tubes BD Biosciences 352235 Use at 1:100
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSR II BD Biosciences
FACSAria II BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  2. Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
  3. Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
  4. Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
  5. Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
  6. Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
  7. Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
  8. Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
  9. Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
  10. Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
  11. Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  12. Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
  13. Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
  14. Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
  15. Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
  16. Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. 187-733 (2011).
  17. Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
  18. Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
  19. Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
  20. Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
  21. Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
  22. Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
  23. Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
  24. Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).

Comments

5 Comments

  1. Hi,

    This is probably your most frequently asked questions. I have the correct Collagenase and I add 30 mg to the ²0 mL prewarmed HBSS with ² mM EDTA. Despite 1 hour at 37 at ²00 the intestine is very stubborn and refuses to digest. I mince it just as described. Any thoughts?? Should I work on increasing the collagenase concentration?

    Many thanks

    Reply
    Posted by: Shehzad S.
    June 13, 2012 - 8:53 AM
  2. Hello there,

    Thank you for your interest in the protocol. Your question seems very perplexing as we have never experienced difficulties with tissue digestion durations greater than 15 minutes, and you seem to be having difficulties after 1 hour. We do not use the ² mM EDTA during tissue digestion and the recommendations I can make are: do not digest the tissue for 1 hour, ensure that you are using an orbital shaker with the 50 ml conical tubes lying horizontally, mince the tissue more finely, and vortex for 50 ml conical tubes after digestion for about 15 to ²0 seconds so that any remaining intestinal tissue is dissociated and digested (you may get some strands of stromal tissue remaining at the end, which is normal). Hope this helps! Please cite our work if you utilize our protocol! Thank you.

    Reply
    Posted by: Duke G.
    June 22, 2012 - 11:16 AM
  3. who can i have a showed vidio play. i want to waching move

    Reply
    Posted by: lee j.
    October 18, 2012 - 9:17 AM
  4. Hi,

    I am using type IV collagenase. I am wondering what U/mg you are using the the type VIII collagenase at?

    Cheers!

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 20, 2012 - 3:17 PM
  5. also,

    I was wondering what is the total cell count you get from 1 small intestine and what cell count you get of cd11c cells per intestine.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 21, 2012 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats