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Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente

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Biology

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Summary

Fluorescente

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

La adhesión de Plasmodium falciparum eritrocitos infectados (IE) a receptores humanos endoteliales durante las infecciones de malaria está mediada por la expresión de PfEMP1 variantes de proteínas codificadas por los genes var.

El P. haploide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 genes diferentes var de que ha sido único que se cree que ser transcrito por célula en un momento durante la fase sanguínea de la infección. Como tal regulación mutuamente excluyente de la transcripción de genes var que se logra es clara, ya que es la identificación de los genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de unión diferencial sobre el resultado clínico de P. infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyentes ha sido puesta en duda por los ensayos de transcripción basado en individuo P. falciparum identificación única transcripción en infeja células eritrocitarias utilizando ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) El análisis de la transcripción de genes var por el parásito en los núcleos individuales de P. falciparum IE 1.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de ARN-FISH para el análisis de la transcripción de genes var en un solo núcleo de P. falciparum infecta los eritrocitos humanos. El método se basa en el uso de digoxigenina y biotina marcado con sondas de ARN antisentido utilizando el TSA Plus fluorescencia sistema de paletas 2 (Perkin Elmer), los análisis microscópicos y recién seleccionado P. falciparum IE. El método de hibridación in situ se puede utilizar para controlar la transcripción y la regulación de una variedad de genes expresados ​​durante las diferentes etapas de la P. ciclo de vida falciparum y es adaptable a otras especies de parásito de la malaria y otros organismos y tipos de células.

Protocol

1. La generación de recién seleccionada eritrocitos infectados

Para este ensayo, los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan cultivos recién seleccionadas para la expresión en superficie de la proteína PfEMP1. En este experimento particular la P. 3D7 linaje falciparum fue seleccionado utilizando anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente 1.

Día 1

  1. Cosecha de 200 l de células de sangre envasados ​​de una P. falciparum cultivo que contiene 2-5% IE etapa tardía por centrifugación a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente.
  2. Se resuspende el sedimento en sangre 2 ml de 37 ° C cálido solución 0,75% de gelatina en un tubo de 14 ml estéril, y se deja durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que el IE no infectado y anillo etapa-a sedimentos.
  3. Se recoge el IE en etapa tardía, es decir, la fase superior, en un tubo de 14 ml nuevo y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado.
  4. Diluir 50 l de anticuerpos específicos anti-PfEMP1 anticuerpos en 2 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado y filtro estéril.
  5. Mezclar el lavado la fase final del IE con los antisueros esterilizado diluida en un tubo de 14 ml estéril y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación suave.
  6. Centrifugue a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente, y se lava dos veces con 10 ml de 37 ° C cálidos RBC-medios de lavado.
  7. Lávese 50 l de Proteína Dynabead Una suspensión dos veces con RBC-lavado de los medios de comunicación utilizando un imán DynaMaq-15.
  8. Resuspender las Dynabeads en 300 L RBC-lavado de los medios de comunicación y añadirlos a la última etapa de lavado IE. Incubar durante 30 min a 37 ° C con agitación suave.
  9. Transferir el tubo en el imán DynaMaq-15. Dejar reposar 1-2 minutos y retirar todo el líquido.
  10. Resuspender las Dynabeads en 4-5 ml de RBC-lavado de medios de comunicación. Transfiera la parte posterior del tubo en el imán y se deja durante 1-2 minutos antes de retirar todo el líquido. Repetir la etapa de lavado una vez.
  11. Transfiera las perlas lavadas a un 25 cm 2 f cultivo estérillask contiene 200 mu l recién concentrados de glóbulos rojos. Añadir 5-6 ml de Albumax medios de comunicación en la cultura. Guarde la noche a 5% de CO 2 a 37 ° C.

Día 2

  1. Eliminar las Dynabeads de la cultura cuando la IE ha seleccionado reinvadido las células rojas de la sangre fresca mediante la transferencia de todo el cultivo a un tubo de 14 ml estéril. Poner el tubo en el imán DynaMaq-15 y se deja durante 1-2 min. Luego, vierta todo el líquido nuevamente a un frasco de cultivo.
  2. Cultura para el mayor número posible de ciclos hasta un 5-10% de parasitemia y los parásitos se encuentran en el ringstage.
  3. Es decir, se analizaron por FACS para asegurarse de que el fenotipo de la superficie correcta, es decir, la expresión de la proteína de cualquiera de and/orPF11_0008 PFD1235w se ha obtenido 1.

2. Preparación de sondas

Las sondas de ARN antisentido se generaron a partir de las regiones más variables de la PFD1235w y la var PF11_0008 </ Em> genes de P. falciparum 3D7 ADN genómico. El ADN fue amplificado por PCR y clonado en el vector pSPT18 o 19 para la transcripción, respectivamente de acuerdo con la descripción del fabricante (Roche). Las sondas (580 pares de bases (pb) y 590 pb de longitud) fueron marcadas con digoxigenina (DIG) o biotina usando un kit de marcaje de ARN DIG o una mezcla de biotina ARN etiquetado, respectivamente. Se confirmó la especificidad de las sondas tanto por análisis de transferencia Northern y por una sola etiqueta análisis FISH 1.

3. Frotis delgado y fijación de los parásitos antes de la hibridación in situ

Día 1

Todos los pasos se realizan en un ambiente libre de RNasa y todos los reactivos son RNasa libre o pre-tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) o RNasa Zap (Invitrogen). Los portaobjetos y cubreobjetos debe limpiarse con alcohol para eliminar la grasa residual de fabricación. Es importante realizar el protocolo sin ninguna pausa entre pasoscon el fin de minimizar el riesgo de contaminación con nucleasas.

  1. Hacer una película delgada de sangre por el método estándar de difusión 3. Usando el lente objetivo 100x aceite del microscopio, cuente el IE y calcular el porcentaje de IE en la cultura. Compruebe que las etapas de parásitos están en sincronía aproximada, en el ring y las primeras etapas del ciclo de trofozoíto IE. Estos son el pre-replicación, etapas uni-nucleado, que expresan mRNA del gen var y adecuado para ensayos de células individuales de transcripción de peces de este tipo.
  2. Transferir 50 l de la cultura parásito, a una parasitemia de 5-10%, a un 1,5 ml de RNasa libre de tubo Eppendorf. Centrifugar durante 1 min a 2.000 rpm a temperatura ambiente.
  3. Retire el papel y añadir 50 l de PBS pH 7,2 en agua tratada con DEPC. Agite suavemente el tubo. Repetir la etapa de sedimentación centrífuga dos veces para lavar las células libres de los medios de comunicación y los residuos celulares.
  4. Haga cuatro buenos frotis finos de calidad. Para cada mancha, hacer un frotis enuno de 11 mm de diámetro y de una diapositiva 4 bien, es decir, cuatro placas de vidrio en total, en una campana de RNasa libre (un paso crítico). Wave desliza brevemente en el aire para secar. Hacer tres diapositivas adicionales para controles de frotis negativo y uno para la tinción única sonda para cualquier gen no pertinente mediante el uso de una sonda específica, otra diapositiva para el tratamiento de RNasa y una tercera diapositiva que contiene IE no expresan el gen de interés. Deje que los portaobjetos se sequen en el banquillo durante 10-20 min.
  5. Fijar las películas delgadas mediante la adición de 60 l de solución de fijación que contiene 4% de paraformaldehído y 5% de ácido acético glacial en los pocillos. Dejar durante 10 minutos en el banquillo a temperatura ambiente.
  6. Lavar los portaobjetos en tampón SSPE 2x por 5 min por agitación suave a temperatura ambiente. Brevemente eliminar el exceso de líquido al tocar los pocillos que contienen las células suavemente con un pañuelo de papel.
  7. Cubrir los portaobjetos con 0,01% de pepsina en HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (un paso extremadamente crítico). Lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Diluir la solución de RNasa hasta una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir los frotis de control negativo con 60 l de la solución de RNasa. Incubar durante 30 min a 37 ° C y lavar los portaobjetos en 2 x SSPE durante 5 min a temperatura ambiente.
  9. Se procede inmediatamente a la etapa de hibridación.

4. La hibridación de sondas de ARN a las diapositivas fijas

Día 1

  1. Prepare la cámara de hibridación, como un Thermostar 100 HC4 o una caja de puntas de pipeta vacía puso en un horno limpio, rociando con RNasa Zap y límpiela con un pañuelo de papel. Llenar los canales de la cámara de hibridación o la parte inferior de la caja con agua tratada con DEPC para asegurarse de que los portaobjetos no se sequen durante la hibridación. Cerrar la cubeta y precalentar a 48 ° C.
  2. Diluir las sondas en la solución de hibridación a una concentración final de 12 ng / l. Desnaturalizar la solución de sonda a 65 ° C durante 5 min en un bloque calefactor. Inmediatamente enfriar en hielo.
  3. En pocas palabras Secar las preparaciones después del lavado 2x SSPE. Retire cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de los pocillos con un pañuelo de papel.
  4. Abra la cámara de hibridación y coloque las diapositivas en la cámara. Aplicar una o ambas sondas en un volumen total de 60 l por pocillo. Cubra cuidadosamente la caída de líquido con un cubreobjetos RNasa libre con unas pinzas estériles.
  5. Cerrar la cámara y se hibridan los portaobjetos a 48 ° C durante al menos 16 horas durante la noche.

5. Conjugación de anticuerpo y amplificación de fluorescencia

Día 2

Los siguientes pasos se basan en el sistema de fluorescencia TSA Plus paleta de Perkin Elmer. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente.

  1. Lavar los portaobjetos 3 veces en tampón TNT por 5 min con agitación suave.
  2. Bloquear los pocillos en 150 l de tampón TNB para 30 min.
  3. Diluir el conjugado HRP-α-DIG anticuerpo en tampón TNB en una proporción de 1:100 y el anticuerpo HRP-conjugado de α-biotina en tampón TNB, en una proporción de 1:500. Retire el exceso de buffer de TNB las diapositivas con un pañuelo de papel. Al detectar simultáneamente dos transcripciones, ambos anticuerpos pueden ir a la vez. Aplique una cantidad total de 100 ml de la solución de anticuerpo por TNB bien y con cuidado cubrir con un cubreobjetos. Incubar los portaobjetos durante 2 horas.
  4. Quitar los cubreobjetos con cuidado. Lavar los portaobjetos en tampón TNT 3 veces durante 5 min.
  5. Diluir la FITC-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500 y se aplican 100 ml de la solución a cada pocillo. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min.
  6. Quite el cubreobjetos con cuidado y lavar los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en tampón de TNT por agitación suave.
  7. Diluir la Cyan3-fluoróforo en el reactivo de amplificación tiramida en una proporción de 1:500. Añadir 100 l porasí de esta solución. Cubrir los pocillos con cubreobjetos y se incuba durante 12 min.
  8. Quite el cubreobjetos con cuidado y luego enjuague los portaobjetos rápidamente por inmersión en una solución tampón TNT.
  9. Lavar los portaobjetos 3 veces con tampón TNT por 5 min.
  10. Sumergir los portaobjetos rápidamente en agua tratada con DEPC.
  11. Deje que los portaobjetos se seque al aire. Montar las diapositivas con anti-fade reactivo que contiene DAPI. Selle las esquinas de las hojas de la cubierta con esmalte de uñas.
  12. Los portaobjetos ahora está listo para la microscopía. Mantenga las diapositivas cubiertas con papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C si el experimento se completará al día siguiente. Un sellado completo de los lados de las láminas puede llevarse a cabo 24 horas después de aplicar el reactivo anti-fade. Esto permitirá que las láminas se fotografió por hasta una semana después de que el protocolo se ha completado.

6. La visualización de las sondas hibridadas

  1. Encender el microscopio. Un microscopio de inmunofluorescencia estándar es sufficient para este tipo de experimento, pero si usted tiene acceso a un microscopio confocal también puede usar esto para imágenes en 3D o para obtener los vídeos de las células teñidas. Permitir microscopio se caliente durante 15-30 min. Encienda el ordenador y el software.
  2. Compruebe la calidad de la tinción al microscopio de inmunofluorescencia. Elija un lugar que contiene unos cuantos parásitos.
  3. Ajuste la ganancia de cada láser manual. Ajuste el pixel de espera en 4-6 m -1 s -1 y los pasos a 512 x 512 píxeles.
  4. Tome una fotografía de prueba utilizando Frame Lambda. Vuelva a ajustar la ganancia del láser.
  5. Tome un mínimo de 20 buenas fotos de fluorescentes células individuales. Al menos 2-5 imágenes de un campo que contiene 5-20 parásitos son necesarios a fin de obtener una visión general ajustada del porcentaje de parásitos positivos.

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Representative Results

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de los pasos principales y el tiempo de duración de la metodología de ARN FISH.

Una serie de imágenes representativas de bien y mal conservados experimentos manchadas de ARNm de peces utilizando solo P. falciparum IE se muestra en la Figura 2. Este protozoo intracelular tiene un pequeño (1-1.5 m de diámetro) núcleo que se tiñe de azul con DAPI. Veinticuatro horas después de la invasión de los eritrocitos en P. falciparum el proceso de esquizogonia, es decir, la división nuclear, comienza. Detección FISH óptimo de la transcripción de genes var se produce en alrededor de 10-22 horas en esta 48 horas intra-eritrocítica ciclo lítico. Las sondas generalmente se hibridan con el ARNm especies que aparecen adyacente al cuerpo principal nuclear, en lo que probablemente nuclear envolvente asociada retículo endoplásmico. Las imágenes de gran calidad de fila Un espectáculo con FITC (verde) y Cyan3-(rojo) sondas marcadas correspondientes a la PFD1235w y PF11_0008 genes var, respectivamente, en la doble P. seleccionado falciparum sub-línea, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-localización de los genes es evidente, pero no absoluta. Fila B muestra la hibridación de ambas sondas pobres a los parásitos que tienen degradados o en gran parte cesó la transcripción mRNA var. En la fila C, una hibridación FISH se obtiene una buena pero la preservación celular es pobre, tal como se muestra por mal extendido y la agregación de los parásitos.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo de ARN FISH experimento. El diagrama de flujo ilustra los puntos principales y el calendario del procedimiento FISH.

Figura 2
Figura 2. Confocal imágenes de ARN-FISH en doble seleccionado P. falciparum indicando simultanous mRNA transcripción de dos genes diferentes var marcado con FITC (verde) o la señal de Cyan3 (rojo). Tinción con DAPI (azul) indica el ADN nuclear parásito. La fila vertical de a1, b1 y c1 mostrar las imágenes de transmisión de los parásitos. Barra de escala 5 micras.

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Discussion

Análisis de ARN FISH, en contraste con los métodos tales como transferencia Northern y RT-PCR, permite la discriminación de los transcritos de ARNm específicos en el nivel de célula única. Esto hace que sea posible discriminar entre células transcripcionalmente activos e inactivos, en este ejemplo, P. falciparum protozoos parásitos dentro de los glóbulos rojos. Tales células enteras observaciones son a menudo necesarias y puede desentrañar los patrones transcripcionales importantes y novedosas 1.

Aunque otros métodos de ARN FISH se han descrito 4-10, ha habido una necesidad para el desarrollo de un nuevo protocolo y refinado para el estudio de la transcripción simultánea ARNm var en P. falciparum. Mediante el uso de sondas asRNA como herramientas de detección, los patrones especiales-temporales de la actividad de mRNA puede ser fácilmente localizado en las células. Además, las sondas asRNA también se puede utilizar en otros sistemas experimentales que apoyan su especificidad 1. Otro críticocos parámetros que son importantes en el desarrollo de un nuevo protocolo incluye la fijación y permeabilzation de las células. Estos pasos se han definido empíricamente ensayando diversos reactivos químicos como sugerido por otros autores 5. Llegamos a la conclusión de que al combinar el lento actuar paraformaldehído reticulante junto con el coagulante ácido acético fijador pudimos obtener una buena conservación de la morfología de los tejidos. Además, nos enteramos de que la pre-bloqueo de las células antes de la adición de las sondas no era necesario, de manera similar a otros protocolos descritos ARN FISH 5. Además, en el presente protocolo se utiliza lavados suaves, una proteasa leve (pepsina) en cantidades bajas y un corto período de incubación para permitir que la sonda y los anticuerpos de difundir en el núcleo y se hibridan con el ARNm unido en el ER, minimizando el daño a las membranas circundantes (Fig. 2A1-2A4).

Además, el ARN FISH y las imágenes de alta resolución generados por la cámarun adjunto al microscopio confocal revela si una célula particular es positivo para la tinción o no, y también proporciona información valiosa acerca de las relaciones espaciales entre el ARN antisentido manchado y el núcleo teñido DAPI. Como se resolvió en las imágenes en la figura 2a4, el ARNm parece estar unida próxima al núcleo, probablemente en el retículo endoplásmico y no en la parte superior de la misma, como se espera en una imagen de ADN-FISH 11-12.

Estudios de células individuales requieren observaciones de numerosos parásitos y en puntos de tiempo diferentes para obtener un resultado estadísticamente significativo. Por lo tanto, el análisis de ARN FISH es una técnica que consume bastante tiempo que requiere paciencia y una considerable experimentación de ensayo y error para calibrar la técnica. Como ARN FISH es una técnica de muchos parámetros una guía de solución de problemas de los pasos principales de este protocolo se presentan en la Tabla 1.

Problema Posible cau Recomendación
Señal débil o sin señal
  • Bajo la expresión de ARNm.
  • la degradación del mRNA.
  • La sonda se degrada, en forma eficiente etiquetado o demasiado baja en la concentración.
  • Temperatura de hibridación demasiado alta.
  • Pepsina Demasiado largo del tratamiento.
  • Las células no se permeabilizaron suficiente.
  • Ver la expresión de la proteína por FACS.
  • El trabajo en condiciones de RNasa libre y utilizar únicamente las soluciones recién preparadas.
  • Hacer una verificación de la calidad de la sonda marcada en gel y comparar a un ARN de control etiquetados. Haga una serie de titulación de la concentración de la sonda en el pescado.
  • Reducir la temperatura de hibridación paso a paso.
  • Reducir la duración del tratamiento con pepsina.
  • Prolongar el tesoro pepsinatamento longitud o probar con otro detergente.
Pobre celular preservación
  • Parasitemia demasiado alta o parásitos estresados.
  • Películas demasiado grueso.
  • Mal limpiar diapositivas.
  • Las células sobre los portaobjetos se deattached.
  • Utilizar un cultivo de parásitos saludable manteniendo la parasitemia por debajo del 10% y el cambio de los medios de células cada día.
  • Diluir el cultivo de parásitos.
  • Limpiar los portaobjetos con alcohol y espere al menos 10 minutos para que los portaobjetos se sequen.
  • Use recién preparada de para-formaldehído y / o aumentar la duración de la incubación paraformaldehído.
Antecedentes de alta
  • Sonda demasiado alta concentración.
  • Un lavado insuficiente deparásitos.
  • Estallando shizonts.
  • La insuficiencia de los lavados posteriores de hibridación.
  • Tampón de bloqueo está contaminado o ineficiente.
  • Haga una serie de titulación de la concentración de la sonda en el pescado.
  • Lavar los parásitos dos veces antes de preparar las películas delgadas.
  • Sincronizar la cultura con más fuerza.
  • Aumentar el número y / o la longitud de los lavados.
  • Prepare nuevo buffer de bloqueo. Pruebe otro reactivo de bloqueo, la concentración o prolongar el período de bloqueo
El control de RNasa tratado es positivo
  • La solución de RNasa está inactivo.
  • Demasiado bajo RNasa concentración.
  • La incubación fue demasiado corto.
  • Prepare una nueva solución de RNasación.
  • Aumentar la concentración. Haga una serie de titulación.
  • Prolongar el período de tratamiento con ARNasa.
Detección de falsos positivos de parásitos de control negativo
  • La sonda no es específica.
  • Los parásitos no expresan el mRNA detectado por la sonda.
  • Comprobar la especificidad de las sondas.
  • Compruebe que la línea parásito utilizado es el adecuado y seleccionado recientemente.

Tabla 1. Orientación Troobleshooting.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores desean dar las gracias a Michael Alifrangis y Abildtrup Ulla para el genotipado de los parásitos y Holm Christina para su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Howard Hughes Medical Institute (subvención de 55.005.511), la Fundación Lundbeck (subvención R9-A840) y por la Fundación Niels Bohr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
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