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भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के द्वारा विस्तार * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

दैहिक स्टेम कोशिकाओं के विस्तार को नियंत्रित एक प्रमुख उनके अध्ययन और चिकित्सा में उपयोग में बाधा कारक है. यहाँ हम एक अस्थायी विकास और वयस्कता के दौरान तंत्रिका स्टेम सेल विस्तार है, जो माउस मस्तिष्क में उत्पन्न न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर नियंत्रण के लिए एक प्रणाली का वर्णन.

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Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

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Abstract

Protocol

प्रारंभिक नोट

सर्जरी पशु कल्याण के लिए स्थानीय अधिकारियों से अनुमोदन पर पूरी तरह से प्रशिक्षित जांचकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए. सभी सावधानियों गहरी संज्ञाहरण, पश्चात analgesia का प्रशासन और संचालन के लिए अधिक से अधिक 10 मिनट, एक आँख स्नेहक के आवेदन करने के लिए corneal निर्जलीकरण और अंधापन को रोकने के स्थायी सहित पशु के लिए प्रवृत्त दर्द और तनाव को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. Anesthetized चूहों 37 में लगातार गर्म रखा जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस तक पूरी वसूली और हर शल्य चिकित्सा उपकरण और बाँझ समाधान होना चाहिए. हालांकि एक जैविक हुड के उपयोग को कड़ाई से आवश्यक नहीं है, ऑपरेटर सभी उचित सावधानी बरतने के लिए आपरेशन के दौरान एक लैब कोट, मुखौटा और दस्ताने पहन कर पशु को संक्रमित करने की संभावना को कम करना चाहिए. इसी तरह, हर कदम पीढ़ी और वायरस के उपयोग के विषय में और अधिकृत किया जाना चाहिए S2 क्षेत्रों में स्थानीय अधिकारियों के नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए.अंत में, सभी उपकरण और सतहों है कि वायरस के साथ संपर्क में हो सकता है की एक पूरी तरह से परिशोधन अनुमोदित सुविधा कीटाणुशोधन प्रथाओं (एचआईवी लिए 70% एट - ओह, और / या वाष्पदावी विसंक्रण से पोंछते द्वारा) के अनुसार किया जाना चाहिए.

भाग 1: भ्रूण एनएससी का विस्तार

1. Utero electroporation

  1. क्लोनिंग के बाद (Clontech) PCMS EGFP या pDSV - mRFPnls 16 वैक्टर में transgenes (cdk4/cyclinD1 यानी), बाँझ पीबीएस में EndoFree किट और resuspend 3-5 ग्राम / μl की एकाग्रता के लिए उपयोग कर plasmids को शुद्ध. सर्जरी से पहले जल्द ही, पीबीएस में 0.05% FastGreen साथ plasmids क्षमताओं की एक अंतिम अनुपात में मिश्रण. 04:04:01 और 2 मिनट के लिए 16,000 XG में मिश्रण को दूर करने के सभी precipitates अपकेंद्रित्र.
  2. एक पहले से खींच लिया borosilicate ग्लास केशिका में डीएनए के मिश्रण लोड. 140, समय: 140; पुल: वेल 200 पुलिंग मापदंडों एक P-97 विंदुक डांड़ी का उपयोग कर रहे हैं. हीट एक रैंप परीक्षण के द्वारा दिया जाता है और कल्पना पर निर्भर करता हैcapillaries के ific बहुत इस्तेमाल किया जा रहा है. है कि utero electroporation मंच (चित्रा 1 ए) के पास है PicoPump की नोक पर केशिका माउंट और एक stereomicroscope तहत, अपने टिप और यह मोड़ बिंदु पर निक मोड़.
  3. एक सूखी ग्लास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में शल्य चिकित्सा उपकरण जीवाणुरहित और गहराई से एक isoflurane vaporizer का उपयोग करते हुए हमल के 12-15 दिन में एक गर्भवती माउस anesthetize. एक हीटिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट मंच पर लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और एक नाक शंकु के माध्यम से निरंतर isoflurane प्रशासन के अधीन रखना.
  4. पेट की त्वचा दाढ़ी, Betaisodona कई बार के साथ कीटाणुरहित, अंत में 70% इथेनॉल के साथ बीच में पोंछते, और buprenorphine (पीबीएस में पतला) 0.1 मिलीग्राम / अग्रकय एनाल्जेसिक के रूप में एकाग्रता किलो subcutaneously इंजेक्षन. ठीक कैंची का प्रयोग, त्वचा की एक 2 सेमी अनुदैर्ध्य कटौती और, अंतर्निहित मांसपेशियों दीवार peritoneal गुहा तक पहुंचने के बाद,. Peritoneal गुहा ca में बांटना. 2मिलीलीटर IUE समाधान (D-पीबीएस 100 यू / मिलीलीटर की कलम / strep युक्त) के 37 में prewarmed ° C और एक हीटिंग ब्लॉक पर समाधान रखने.
  5. कवर बाँझ एक विदर uteri जिसमें से हटाया जाएगा युक्त ड्रॉप के साथ माउस. एक टंगस्टन प्रत्याकर्षक का उपयोग चीरा वापस लेना है, गर्भाशय की पहचान करने और उसे बाहर खींच यह आसन्न भ्रूण के बीच संदंश (चित्रा 1B, बाएं) के साथ पकड़ और अंत में यह बाँझ ड्रॉप पर नीचे रखना. पूरे ऑपरेशन के दौरान, IUE अंग और शरीर गुहा moisturize और जानवर के निर्जलीकरण को रोकने के समाधान के साथ गर्भाशय कुल्ला.
  6. ध्यान अंगूठे और सूचकांक के बीच पकड़ गर्भाशय संभाल और एक भ्रूण की बारी है जब तक उसके सिर दिखाई देता है और ऑपरेटर की ओर उन्मुख है. Telencephalic गोलार्द्धों पहचानें और उनमें से एक dorso पार्श्व की ओर से इंजेक्षन. डीएनए एक PicoPump की footswitch का उपयोग कर समाधान की 1-2 μl रिलीज जब तक निलय FastGreen (चित्रा 1B, सही है) द्वारा उल्लिखित है.
  7. (चित्रा 1C) कैथोड पर इलेक्ट्रोड anode और 50 एमएस के लिए प्रत्येक नाड़ी के बीच 950 ms अंतराल एक वर्ग के आकार का बिजली क्षेत्रों पैदा electroporator का उपयोग के साथ 30 वी के 6 दालों देने संचालित एक footswitch के माध्यम से. इलेक्ट्रोड प्लेसेंटा से बंद के रूप में इस रक्तस्राव और भ्रूण को नुकसान का कारण हो सकता है रखने से बचें.
  8. जब सभी भ्रूण इंजेक्शन और electroporated, गर्भाशय वापस उदर गुहा में और जगह एक हर 3-4 मिमी सीवन suturing स्ट्रिंग के साथ पेशी दीवारों बंद. समुद्री मील पेशी के लिए गरम होना चाहिए लेकिन ऊतक के एक छोटे से सूजन की अनुमति भी तंग नहीं. अंत में, overlying त्वचा धातु क्लिप का उपयोग बंद. Betaisodona साथ त्वचा कीटाणुरहित isoflurane मुखौटा से माउस को हटाने और यह एक आवास पूरी तरह से जब जाग पिंजरे में स्थानांतरण. मॉनिटर के माउस की वसूली जब तक हरकत व्यवहार सामान्य है.

2. सैम के प्रसंस्करणमिसाल

  1. Electroporation एक या एक से अधिक दिनों के बाद, माउस बलिदान, भ्रूण इकट्ठा और सही ढंग से एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope (चित्रा 1D) का उपयोग electroporated उन लोगों की पहचान. ठंडा पीबीएस पर दिमाग टुकड़े करना, और उन्हें 4% पीएफए ​​(फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच में paraformaldehyde) में रात को ठीक. आखिरकार, BrdU अलग मानदंड के अनुसार बलिदान से पहले प्रशासित किया जा सकता है कोशिका चक्र कैनेटीक्स और सेल प्रसार 3 की जांच.
  2. दिमाग तो सेक्शनिंग और रेडियल glia की कई मार्करों, बेसल progenitors और न्यूरॉन्स (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 आदि) के लिए immunostaining लक्षित एनएससी और कर रहे हैं कि उनकी संतान पर कार्यात्मक transgenes के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए कार्रवाई कर रहे सह electroporated रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की है.

चित्रा 1
चित्रा 1.Utero electroporation में (ए) utero electroporation मंच में एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (बी) चित्र सर्जरी के दौरान गर्भवती माउस की स्थिति (दाएं) और / डीएनए FastGreen एक माउस भ्रूण (बाएं) की telencephalic गोलार्द्ध में मिश्रण (नीला) के इंजेक्शन दिखा. (सी) स्कीम (+) anode इंजेक्शन के स्थल (नीला) के लिए निकट के साथ गर्भाशय की दीवारों के साथ संपर्क में इलेक्ट्रोड के स्थान दिखा. तीर anode ओर डीएनए के प्रवास से संकेत मिलता है. (डी) भ्रूण 13 दिन में GFP plasmids साथ electroporation के बाद एक माउस भ्रूण 24 घंटे का चित्र. डैश्ड लाइन telencephalic गोलार्द्ध सीमांकित करता है. Calegari एट अल से संशोधित, 2004 17 में योजना.

भाग 2: वयस्क एनएससी का विस्तार

1. एचआईवी व्युत्पन्न वायरल कणों का उत्पादन

  1. दिन 1: 5 प्लेट x 10 एक 10 सेमी 6 293T कोशिकाओंD-सदस्य गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के 10% और 100 यू / कलम / strep (मध्यम संस्कृति) की मिलीलीटर युक्त 8 मिलीग्राम के साथ पकवान. एक वायरल तैयारी और रातोंरात संस्कृति के लिए 37 में 15 व्यंजन ° सी, 5% सीओ 2 का प्रयोग करें.
  2. दिन 2: हर डिश के लिए, सादे D-सदस्य 3 plasmids के लिए मैं प्रत्येक एन्कोडिंग की 5 ग्राम के 1 मिलीलीटर में जलमिश्रित) (vesicular stomatitis वायरस टाइप जी) VSVG लिफाफा प्रोटीन, ii) धोखा - धड़ी करना / नीति (समूह विशिष्ट प्रतिजन / पोलीमरेज़) , और iii) एक polycistronic कार्यात्मक और रिपोर्टर transgenes (यानी cdk4/cyclinD1/GFP) पहले एक हस्तांतरण एचआईवी आधारित (p6NST90) 9 वेक्टर में क्लोन को व्यक्त करने का निर्माण किया. D-सदस्य polyethylenimine की 45 μl कि पीबीएस में किया गया है पहले से कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान और सेते में भंग युक्त 1 मिलीलीटर के साथ मिश्रण इस समाधान. इस बीच में, कोशिकाओं से मीडिया को हटाने और ताजा डी - सदस्य के पकवान गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम का 15% और 100 यू / कलम / strep की मिलीलीटर युक्त प्रति 4 मिलीलीटर जोड़ें. 2 मीटर जोड़ेंअभिकर्मक मिश्रण और संस्कृति रातोंरात के एल.
  3. दिन 3: 500 मिमी की 120 μl पकवान transgenes की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के प्रति ना butyrate जोड़ने के लिए, जिसके बाद मध्यम संस्कृति के 5 मिलीलीटर के के साथ अभिकर्मक माध्यम की जगह 6-8 घंटा के लिए धीरे और संस्कृति मिश्रण.
  4. 4 दिन: supernatants (ca. कुल 70 मिलीलीटर) को इकट्ठा करने के लिए, एक 0.22 सुक्ष्ममापी और 2 polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूबों (35 x 89 मिमी) में फिल्टर हस्तांतरण के माध्यम से गुजरती हैं. 110.000 XG 4 बजे 90 मिनट के लिए ultracentrifuge ° C एक स्विंग रोटर का उपयोग. तैरनेवाला त्यागें, प्रत्येक ट्यूब पीबीएस के 6 मिलीलीटर जोड़ने और बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. गोली Resuspend और यह एक polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूब (14 x 95 मिमी) में स्थानांतरित. 110.000 XG 4 बजे 90 मिनट के लिए ultracentrifuge ° C एक स्विंग रोटर का उपयोग. तैरनेवाला त्यागें, पीबीएस के 50 μl में गोली resuspend -80 में 5 μl aliquots और दुकान डिग्री सेल्सियस वायरल titer 10 8 -10 9 CFU / एमएल की सीमा में हो जाएगा. (नोट: वायरस बहुत तापमान और भंडारण avo, प्रति संवेदनशील हैंपरिवहन के दौरान फिर से ठंड आईडी, सूखी बर्फ पर रखने के लिए और उपयोग करने से पहले ही पिघलना करने के लिए.)

2. Stereotaxic इंजेक्शन

  1. Isoflurane के साथ एक 6-10 सप्ताह पुराने माउस anesthetize और एक stereotaxic (2A चित्रा) फ्रेम कान सलाखों और तालू समर्थन का उपयोग करने के लिए ठीक से सिर को ठीक करने पर प्रवण स्थिति में पशु जगह. जानवर एक हीटिंग पैड पर 37 डिग्री सेल्सियस पर और लगातार isoflurane प्रशासन के तहत निर्धारित गर्म रखा है.
  2. Subcutaneously buprenorphine अग्रकय एनाल्जेसिक के रूप में काम कर समाधान के 100 μl सुई, माउस के सिर पर त्वचा की एक पट्टी दाढ़ी, और desinfect रूप में 1.4 में वर्णित हैं. एक स्केलपेल का उपयोग, में एक कैरियर बनाने. 1.5 सेमी सिर बाण के समान सीवन के स्तर पर खोपड़ी को उजागर त्वचा पर लंबी अनुदैर्ध्य चीरा. त्वचा वापस लेना और एक बाँझ कपास कली के साथ धीरे हड्डी की सतह को साफ.
  3. पैराफिन तेल के साथ एक केशिका गिलास (1.2 में विनिर्देशों) आधा भरने और यह सुई लगानेवाला पंप डालने पर माउंटदूसरी अंगूठी (चित्रा 2B) तक केशिका. एक्स, वाई और z अक्ष में केशिका धारक ले जाएँ जब तक केशिका की नोक शीर्षस्थान, बाण के समान और पार्श्व sutures (चित्रा 2C) (एक stereomicroscope की मदद से निर्धारित किया जा सकता है) के बीच संयोजन बिंदु पर तैनात है, और फिर सेट एक्स, वाई, जेड और मूल्यों के लिए 0.
  4. ± Medio पार्श्व अक्ष में 1.6 मिमी (x) और -1.9 मिमी केशिका और अक्ष पूर्वकाल पीछे (y) में स्थानांतरित एक शल्य मार्कर पेन का उपयोग कर हड्डी के निशान. क्षमताओं की एक छेद बनाओ. एक बिजली के ध्यान देने के लिए दिमाग को नुकसान नहीं बरमे का उपयोग खोपड़ी पर 0.5 मिमी व्यास.
  5. कान सलाखों पर रखा parafilm का एक टुकड़ा पर एक 5 वायरल निलंबन के μl छोटी बूंद (1 अशेष भाजक) रखो और छोटी बूंद में केशिका की नोक immerge. Ca चूसो. वायरल एक nanoliter सुई लगानेवाला का उपयोग कर निलंबन के 3.5 μl 55 nl / सेकंड में निर्धारित किया है. इस कदम तेजी से अमल के रूप में छोटी बूंद लुप्त हो जाना जाएगा.
  6. साइट ओ केशिका ले जाएँच इंजेक्शन और यह कदम नीचे जब तक टिप PIAL सतह छू. 0 से रीसेट अक्ष dorso उदर मूल्य (z). इस बिंदु पर, के साथ केशिका -1.9 मिमी के लिए ऊतक और घुसना nl 4 / सेकंड की दर में वायरल निलंबन के 1.5 μl जारी. 2-3 मिनट के लिए रुको वायरल निलंबन गर्त केशिका ट्रैक की backflow को कम करने के लिए और फिर वापस लेना केशिका. एक दूसरे इंजेक्शन controlateral गोलार्द्ध में प्रदर्शन किया जा सकता है.
  7. त्वचा सीवन, शुद्ध करना, और जानवर संज्ञाहरण से उबरने के लिए पहले utero electroporation (1.8) में वर्णित अनुमति देते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Stereotaxic वायरल इंजेक्शन (ए और बी) stereotaxic (A) इंजेक्शन और एक disassembled केशिका में एक कैरियर की प्रविष्टि दिखा धारक प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक उपकरणों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वदूसरी अंगूठी जब तक pillary (बी). (सी) माउस सिर की त्वचा के साथ कान और तालू समर्थन सलाखों के द्वारा immobilized का चित्र खोपड़ी (बाएं) का पर्दाफाश में कटौती. डॉटेड बॉक्स की बढ़ाई (दाएं) पार्श्व और बाण के समान sutures, शीर्षस्थान, और इंजेक्शन (चक्र) की साइट से पता चलता है.

3. नमूने के प्रसंस्करण

  1. एक से तीन सप्ताह के बाद संक्रमण की क्षमताओं के साथ माउस छिड़कना. 4% पीएफए ​​की 100 मिलीलीटर, मस्तिष्क काटना और यह 4% पीएफए ​​में रातोंरात परसर्ग. आखिरकार, BrdU और / या tamoxifen अलग मानदंड के अनुसार बलिदान से पहले प्रशासित किया जा सकता है कोशिका चक्र कैनेटीक्स की जांच और वायरल loxP साइटों द्वारा flanked transgenes की अभिव्यक्ति को रोकने, क्रमशः 9.
  2. मस्तिष्क स्टेम और progenitors कोशिकाओं और न्यूरॉन्स (जैसे Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin, आदि) के कई मार्कर का उपयोग immunostaining के लिए तो संसाधित किया जा सकता है.

Representative Results

  1. कुल मिलाकर, utero electroporation में electroporated पार्श्व प्रांतस्था (चित्रा 3A) के एक व्यापक क्षेत्र में रिपोर्टर जीन की मजबूत अभिव्यक्ति प्रदर्शित भ्रूण की 60-80% पैदावार. पूरे माउंट भ्रूण पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन को आसानी से किया जा सकता है के रूप में 3-6 घंटे के रूप में जल्द ही एक से अधिक सप्ताह के लिए स्थायी संकेत के साथ सर्जरी के बाद पता चला. लक्षित क्षेत्र के भीतर, कोशिकाओं के 30-50% के बारे में आमतौर पर 6,8 दो (या अधिक) के सह electroporated आम तौर पर 90% से ऊपर जा रहा है transgenes (3B चित्रा, बाएं) सह व्यक्त कोशिकाओं का अनुपात के साथ (ओं) transgene व्यक्त 15. जबकि apoptosis (ca. 2.0-2.5%) के एक न्यूनतम स्तर electroporation से लगभग 2 घंटे के बाद देखा जा सकता है, इस मूल्य के बारे में 6 घंटे के बाद शारीरिक स्तर (ca. 0.5-1.0%) (एफसी, अप्रकाशित डेटा) के लिए वापस आ जाएगी. भ्रूण या गर्भवती चूहों के अनुपात सर्जरी की वजह से मर रहा है आम तौर पर नगण्य है (<5%) है. इन शर्तों के तहत cdk4/cyclinD1 साथ सह electroporation 4 द्वारा पीछाविकास के 8 घंटे के 30% से तंत्रिका पूर्वज का विस्तार (3B चित्रा, सही, और सी) 15 में एक वृद्धि हो सके.

चित्रा 3
चित्रा 3. तंत्रिका progenitors cdk4/cyclinD1 overexpression द्वारा विस्तार. (ए) GFP और आरएफपी plasmids साथ electroporation भ्रूण 13 दिन में 24 घंटे के बाद एक माउस भ्रूण के पार्श्व प्रांतस्था के माध्यम से एक अनुभाग प्रतिदीप्ति तस्वीर. (बी) के सह cdk4/GFP और cyclinD1/RFP बेसल पूर्वज Tbr2 मार्कर के लिए और plasmids immunolabeling के साथ electroporation के बाद 48 घंटे में प्रतिदीप्त तस्वीरें. DAPI (बाएं) counterstainig और Tbr2 साथ फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से (दाएं) दिखाए जाते हैं. और subventricular क्षेत्र की सीमाओं को (SVZ, पीले धराशायी लाइनों); लाइन्स वेंट्रिकुलर क्षेत्र के शिखर सतह (सफेद लाइन VZ) इंगित करता है. वृद्धि की थी नोटप्रांतस्था के electroporated भाग (सफेद arrowheads) एक बढ़ा पीढ़ी और बेसल progenitors के बाद cdk4/cyclinD1 की overexpression विस्तार के कारण में SVZ ckness. पी <0.05, 3 एन = (सी) प्रभाव की मात्रा बी = एसडी बार्स में दिखाया गया है. सी में बार ग्राफ Lange एट अल., 15 2009 से लिया जाता है.

  1. के बाद वायरल stereotaxic इंजेक्शन, ca. संचालित चूहों के 80% पूरे दांतेदार गाइरस भर में transgenes की मजबूत अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करते हैं. GFP की अभिव्यक्ति विधान 40 सुक्ष्ममापी वर्गों पर आसानी से पता लगाया जा सकता है और सर्जरी के बाद के रूप में 4 दिनों के रूप में जल्द ही. व्याख्यान चबूतरे वाला करने लांगुलिय दांतेदार गाइरस की धुरी के साथ कोशिकाओं के बारे में 10-30% (क्षमताओं की एक कुल 10,000-30,000 कोशिकाओं के बराबर) आम तौर पर व्यक्त transgene (ओं) (4A चित्रा) 9. कारण सर्जरी के लिए मरने के चूहों के अनुपात में नगण्य है (<5%). तीनों cdk4/cyclinD1 की इन शर्तों के तहत सप्ताह overexpression एनएससी में एक से अधिक वृद्धि हो सके दोपरतों (4B चित्रा), जबकि 70 (चित्रा 4C) 9% से neurogenesis कम.

चित्रा 4
चित्रा 4. वायरल संक्रमण के प्रभाव (ए) 7 प्रतिदीप्ति व्याख्यान चबूतरे वाला करने लांगुलिय हिप्पोकैम्पस की धुरी के साथ 40 सुक्ष्ममापी मोटी धारावाहिक राज्याभिषेक वर्गों (1 हर 6 इकट्ठा करने) से ली गई तस्वीरों के 3D पुनर्निर्माण. GFP + संक्रमित कोशिकाओं (हरा) और DAPI दांतेदार गाइरस के परमाणु धुंधला हो जाना (नीला) (ऊपर) दिखाए जाते हैं. राज्याभिषेक में एक (मध्य) और हरे रंग pseudocolor (एलन मस्तिष्क एटलस से संशोधित; में प्रकाश डाला हिप्पोकैम्पस साथ पूरे मस्तिष्क गोलार्द्ध के 3 डी प्रतिनिधित्व (नीचे) दिखाया उन लोगों के लिए इसी वर्गों के उज्ज्वल क्षेत्र चित्रों www.brain map.org ) . सफेद तीर इंजेक्शन के स्थल बिंदु. पार्श्व (एल), (नि.) व्याख्यान चबूतरे वाला, और एक प्रकार का गुबरैलासाल अक्षों (डी) (एक्स, वाई, जेड और stereotaxic निर्देशांक) (दाएं) संकेत कर रहे हैं. के अनुपात nestin + (बी) एनएससी और DCX + GFP की आबादी के भीतर नवजात न्यूरॉन्स (सी) + (सफेद) GFP या cdk4/cyclinD1/GFP stereotaxic इंजेक्शन वायरस (काला) 3 सप्ताह के बाद संक्रमित कोशिकाओं (बी और सी). बार्स = एसडी, 0.005 <; p n = 3. बी और सी में रेखांकन Artegiani एट अल, 2011 से लिया.

Discussion

Utero electroporation में के लिए एक महत्वपूर्ण कदम गुणवत्ता और बिजली क्षेत्र के वितरण के दौरान अपने दिशात्मक प्रवास अपने आरोप पर निर्भर करता है, क्योंकि डीएनए की पवित्रता है. डीएनए शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल है कि endotoxins के रूप में अतिरिक्त चार्ज अणुओं के हटाने शामिल नहीं है, प्राकृतिक डीएनए नकारात्मक गरीब वितरण के लिए अग्रणी प्रभार मास्किंग के लिए हो सकता है. जाहिर है, के रूप में करीब क्षेत्र को लक्षित किया जा करने के लिए संभव इलेक्ट्रोड के साथ गर्भाशय दीवारों को छू electroporation कार्यकुशलता में सुधार होगा. समान रूप से महत्वपूर्ण है इस्तेमाल के बाद यह इष्टतम बिजली क्षेत्र के वितरण के लिए मौलिक है इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता है. आंख और / या सीरम के निशान, lipids, और इतना आगे जैसे जैविक अवशेष, द्वारा भी दिखाई नहीं माइक्रो खरोंच, अनिवार्य रूप से समय पर जमा उनके गुणों को खोने के इलेक्ट्रोड के लिए अग्रणी होगा. पुरानी और / या गंदे electropes electroporation दक्षता में अचानक गिरावट का सबसे संभावित कारण हैं, और इस प्रकार r होना चाहिएeplaced के रूप में जल्द ही के रूप में यह देखा है. जबकि अपेक्षाकृत सरल है, आम तौर पर utero electroporation में प्रशिक्षण के कुछ हफ्तों की आवश्यकता है क्रम में संतोषजनक ढंग से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के. इस तकनीक से बहुत बहुमुखी है के बाद से यह लागू किया जा सकता है वस्तुतः किसी भी और विकासशील भ्रूण के अंग के ऊतकों,. निश्चित रूप से मस्तिष्क के रूप में एक गुहा, युक्त अंगों के लिए लक्ष्य और ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए के एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में इंजेक्शन लगाने की आसानी के कारण कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात के लिए अनुमति देने के लिए विशेष रूप से आसान कर रहे हैं.

एक आम stereotaxic वायरल इंजेक्शन की स्थापना में समस्या का सामना करना पड़ा कुछ संक्रमित कोशिकाओं और / या अवांछित क्षेत्रों को लक्षित है. पहली समस्या मुख्य रूप से कम टिटर वायरस के इंजेक्शन के साथ सहसंबद्ध है. संस्कृति में मार्ग की कम संख्या के साथ 293T कोशिकाओं तेजी से बढ़ने और उच्च वायरल titers सीसा. Ca से अधिक पुराने कोशिकाओं का उपयोग करना. 20 मार्ग की सिफारिश की है और कम से कम 80% दक्षता के साथ अभिकर्मक का मतलब है एक अच्छा सुनिश्चित नहीं होगावायरल उत्पादन. वायरल गोली की Resuspension भी महत्वपूर्ण है, वायरल निलंबन समरूप और वायरल clumps है कि रोक देना केशिका को टाला जा सकता है दिखाई देते हैं. वायरस तापमान बूँदें और लंबी अवधि के भंडारण के लिए बहुत संवेदनशील हैं. इस कारणों के लिए, aliquots स्थायी रूप से -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा और refrozen नहीं किया जा सकता है की जरूरत है. यहां तक ​​कि इन शर्तों के तहत, संक्रामकता में एक कमी के भंडारण के 6-12 महीने के बाद देखा जा सकता है. सीखने के चरणों में, हम करने के लिए प्रत्येक वायरल तैयारी के वायरल titer परीक्षण और यह लंबी अवधि के भंडारण के बाद फिर से करना का सुझाव देते हैं. मस्तिष्क के अवांछित क्षेत्रों में संक्रमित कोशिकाओं की उपस्थिति stereotaxic फ्रेम, जो कुछ अभ्यास की आवश्यकता पर एक माउस सिर के suboptimal स्थिति पर निर्भर कर सकते हैं. इसके अलावा, यह करने के लिए मस्तिष्क की सतह को नुकसान नहीं है, जबकि खोपड़ी पर छेद खोलने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि अन्यथा यह संभव नहीं हो सकता है सही ढंग से करने के लिए 0 PIAL सतह पर, रीसेट imprecise इंजेक्शन में जिसके परिणामस्वरूप. निर्देशांककि हम इस प्रोटोकॉल में प्रदान C57/BL6 6-10 सप्ताह पुराने महिलाओं के लिए निर्दिष्ट कर रहे हैं और हम उन्हें अलग तनाव / / उम्र, लिंग के लिए अनुकूलन सुझाव. इस तकनीक का अधिग्रहण अब चरणों तैयार करने के लिए वायरस और नमूनों का विश्लेषण करने की जरूरत के कारण utero electroporation में से भी अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है. हम पुरजोर अनुशंसा है कि वायरस के बाद ही माउस सर्जरी और stereotaxic इंजेक्शन विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बन गए हैं उपयोग किया जाता है. 1 इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए कदम euthanized चूहों में सेल permeant Hoechst 33342 के रूप में इस तरह के डीएनए रंजक, सुई और तुरंत दिमाग का विश्लेषण है.

Utero electroporation और stereotaxic वायरल इंजेक्शन में दो तीव्रता शक्तिशाली प्रणाली और ऊतक CNS के भीतर विशेष रूप से स्तनधारी विकास और वयस्कता के दौरान जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर कर रहे हैं. केवल कोशिकाओं के एक subpopulation लक्ष्यीकरण में अपनी सीमा के बावजूद, इन प्रणालियों एक अभूतपूर्व गति प्रदान करते हैं और आसानी के रूप में अधिक पारंपरिक तरीकों की तुलना में, मैंn ट्रांसजेनिक चूहों की विशेष श्रमसाध्य और समय लेने वाली पीढ़ी. फिर भी, इस समानता के बावजूद, दो तकनीक है कि उल्लेख के लायक हैं के बीच कई मतभेद मौजूद हैं. पहला, utero electroporation में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए संबंध के साथ शुरू में स्टेम कोशिकाओं (भी बुलाया रेडियल glial कोशिकाओं) उचित अभिकर्मक ओर जाता है क्योंकि ये केवल निलय जहां डीएनए इंजेक्ट किया जाता है परिसीमन कोशिकाओं रहे हैं. कोशिका विभाजन की एक परिणाम के रूप में, plasmids बाद में लक्षित, माँ स्टेम कोशिकाओं से उनके पूर्वज और / या neuronal बेटी समय के एक समारोह के रूप में प्रांतस्था भर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पुनर्वितरण के लिए अग्रणी कोशिकाओं को विरासत में मिली हो. इसके विपरीत, वयस्क दिमाग में एचआईवी lentiviruses का उपयोग किसी भी सेल स्टेम सेल, progenitors, न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिपक्व glial कोशिकाओं सहित प्रकार के एक साथ संक्रमण की ओर जाता है. ध्यान से, एचआईवी lentiviruses का उपयोग कर के रूप में और आमतौर पर इस्तेमाल किया रेट्रोवायरस के विरोध के संबंध में तथ्य यह हैकि lentiviral एकीकरण कोशिकाओं के mitotic राज्य से स्वतंत्र होते हैं, इस प्रकार भी वयस्क, मौन स्टेम कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण की अनुमति होती है.

दूसरा, electroporation और वायरल संक्रमण के बीच एक और महत्वपूर्ण अंतर यह है कि एक अस्थायी, episomal अभिव्यक्ति पूर्व द्वारा हासिल की है रूप में संक्रमित बाद द्वारा हासिल की कोशिकाओं के जीनोम में डीएनए के अपरिवर्तनीय एकीकरण का विरोध किया है. लगातार सेल डिवीजनों, electroporated plasmids के कमजोर पड़ने, और अस्थानिक cyclinD1 प्रोटीन की गिरावट का एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक कोशिका चक्र में पीछा करना होगा. इस प्रकार, एनएससी के भ्रूण के विकास के दौरान विस्तार दो लगभग 15 दिनों के लिए पिछले ही दिखाया गया था, जबकि वयस्क दिमाग में इस आशय के लिए कई महीनों के लिए (अप्रकाशित परिणाम) रहता पाया गया था.

तीसरा, जब से मैं) cdk4/cyclinD1 एक लंबी G1 और द्वितीय के साथ कोशिकाओं पर एक मजबूत प्रभाव है) के विकास के दौरान प्रतिबद्ध तंत्रिका progenitors अब एक सेल चक्रस्टेम कोशिकाओं की तुलना जबकि विपरीत वयस्कता के दौरान सच है, हमारे दो जोड़तोड़ की वयस्कता के दौरान विकास और स्टेम कोशिकाओं के दौरान मुख्य रूप से तंत्रिका progenitors की, विस्तार ट्रिगर पाए गए. या तो मामले में न्यूरॉन्स में एक वृद्धि दोनों तरीकों से हासिल किया गया.

चौथा, वायरल इंजेक्शन आसानी से प्रदर्शन कर सकते हैं और मज़बूती reproducibly, बस stereotaxic निर्देशांक बदलने द्वारा वयस्क दिमाग के कई अलग अलग क्षेत्रों में. इसके विपरीत, utero electroporation में मस्तिष्क स्टेम, hippocampal गठन, या रीढ़ की हड्डी के रूप में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कुछ क्षेत्रों के सटीक लक्ष्यीकरण अधिक मुश्किल के लिए reproducibly हासिल हो सकता है. इसके अलावा, जबकि stereotaxic इंजेक्शन किसी भी उम्र के चूहों पर किया जा सकता है, के utero electroporation में अनुकूलतम प्रदर्शन E16 E11 के बारे में सीमित है. पहले E11 चरणों या तो एक अल्ट्रासाउंड backscatter 18,19 माइक्रोस्कोप का उपयोग करें या एक पूरे भ्रूण पंथ की आवश्यकता होगीure प्रणाली 17,20.

हाल ही में, दैहिक स्टेम कोशिकाओं के बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान में एक बढ़ती रुचि है क्योंकि उनके अध्ययन और हेरफेर करने के लिए उपन्यास सेल आधारित पुनर्योजी चिकित्सा के विकास की दिशा में मौलिक माना जाता है पदोन्नत किया गया है. Cdk4/cyclinD1 की overexpression के लिए विशेष रूप से, हमारे प्रोटोकॉल के लिए अस्थायी रूप से vivo में एनएससी (चित्रा 3 बी और सी और 4B और सी) के विस्तार को बढ़ाने के क्रम में वयस्क दिमाग में उत्पन्न न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि करने के लिए साधन प्रदान करता है. हम मानते हैं कि इन हेरफेर अलग संदर्भों की संख्या में महत्वपूर्ण होने के लिए बेहतर मस्तिष्क के विकास, विकास, और संज्ञानात्मक समारोह या तंत्रिका अध: पतन या चोट से वसूली करने के लिए उनके योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से homeostasis में एनएससी की भूमिका को समझ सकते हैं.

Disclosures

बीए और एफसी एक पेटेंट cdk4/cyclinD1 वायरस (10160288.6 EP) द्वारा वयस्क दैहिक स्टेम कोशिकाओं की सशर्त विस्तार का वर्णन आवेदन प्रस्तुत किया है.

Acknowledgments

इस काम पुनर्योजी चिकित्सा, टीयू ड्रेसडेन के मेडिकल संकाय, और DFG सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB655 (subproject A20) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. बीए प्रोग्राम खोदता-BB, ड्रेस्डन के एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. हम डीआरएस धन्यवाद. Noriko Osumi, Tadashi नोमुरा, Dieter Chichung लेटें, और utero electroporation और stereotaxic वायरल इंजेक्शन में स्थापना के दौरान कीमती सलाह के लिए रवि Jagasia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

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References

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