ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es determinar la función génica mediante el uso de ARN de interferencia basado en vectores de ADN. Esto se logra diseñando y generando primero construcciones S-H-R-N-A que se dirigen a genes específicos. El segundo paso es producir lentivirus que lleve el casete de expresión de ARN SH.

A continuación, se generan líneas celulares estables infectando células con el lentivirus y las células infectadas con el lentivirus se utilizan en diversos ensayos in vitro e in vivo para determinar los efectos del silenciamiento del gen de interés. En última instancia, dependiendo de los ensayos utilizados, los resultados pueden mostrar cambios en la genicidad tumoral de las células como resultado de la eliminación de genes mediante el uso de ensayos de proliferación, migración e invasión in vitro, así como modelos de formación de xenoinjertos in vivo. La demostración del procedimiento será Daniel Stowell, ma Juan, y Daniel es un estudiante graduado en mi laboratorio, Ma Ma es un técnico.

Chang es becario postdoctoral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como si un gen específico tiene un papel en el desarrollo y la progresión del cáncer, y para qué aspectos de estos procesos puede ser importante. Para comenzar, diseñar y ordenar los oligonucleótidos en base a los criterios descritos: Anil los dos oligonucleótidos complementarios inversos que contienen la secuencia diana de 20 a 23 nucleótidos en el gen diana.

Formarán los sitios eco R one y Hindi tres en los dos extremos. Después de estar arrodillado, otro oligo contiene una secuencia complementaria inversa a la secuencia objetivo, y sus tres extremos primos. Neils al extremo de los tres primos del promotor H one o U six con un cebador aguas arriba.

Use una PCR para crear un fragmento que tenga BAM H uno y tres sitios Hindi en cada extremo. Mientras tanto, digiere el vector lentivirus y el fragmento de PCR. A continuación, lleve a cabo una reacción de ligadura de tres fragmentos entre el vector, el fragmento de PCR y los oligonucleótidos de Anil.

En una proporción molar de uno a 10 a 10, el vector resultante producirá el ARNh de interés con una secuencia de tres en hindi en la región del bucle. Si se utiliza un vector inducible, la producción de ARNh dependerá de la presencia de una molécula inductora como la doxiciclina para el sistema Tet on. Ahora transforme las células alfa de E. coli DH cinco altamente eficientes y competentes utilizando el producto ligado e identifique los vectores positivos utilizando una prueba de PCR basada en colonias.

Amplificar un producto que abarca el vector y el sitio de ligadura del promotor inducible. Prepare el ADN plasmático de las colonias positivas con un kit comercial. A continuación, confirme la presencia del inserto mediante digestión BAM H one y ECO R one y mediante electroforesis de ADN agarosa.

Además, secuencie la región que contiene el promotor y S-H-R-N-A utilizando el nucleótido LIGA P cinco. Usando un kit de preparación MIDI o maxi libre de endotoxinas, prepare el ADN del lentivirus que lleva el casete de expresión de HRNA. Determine la concentración de ADN midiendo la absorción de luz a 260 nanómetros y asegure la pureza del DN a comprobando que la relación de absorción de luz de 260 a 280 nanómetros esté entre 1,8 y 2,0.

Finalmente, ejecute el plásmido de lentivirus en un aerogel para asegurarse de que esté enrollado en S Antes de la transfección, prepárese para la transfección dejando caer primero lentamente 0,9 mililitros de solución A en 0,9 mililitros de solución B mientras burbujea aire a través de la solución B con una pipeta. A continuación, incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, deje caer lentamente 0,6 mililitros de la mezcla en tres placas diferentes de 10 centímetros con células T HEK 2 93.

Luego, regrese las celdas a la incubadora de cuatro a seis horas después. Reemplace el medio con siete mililitros de medio DMEM completo. Después de 24 horas, agregue cinco mililitros más de medio, y después de otras 24 horas, coseche el medio que contiene el lentivirus.

Gire el medio cosechado a 1500 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Filtre el sobrenadante con un filtro de 0,45 micrómetros. Gire el flujo a través del medio que contiene el lentivirus por ultra centrifugación.

Decantar el sobrenadante en un contenedor de residuos que contenga un 5% de lejía. Vuelva a suspender el pellet de lentivirus en medio a un mililitro de XPBS frío. A continuación, divida la solución de lentivirus en alícuotas de 50 a 100 microlitros para almacenarla a menos 80 grados centígrados.

Por último, determine el título del lentivirus utilizando una técnica fiable. Por lo general, una placa de cultivo de 10 centímetros producirá de 50 a 100 millones de unidades infecciosas antes de proceder con la infección celular. Determine el momento de inercia del título lentiviral utilizando un kit o R-T-P-C-R para este procedimiento.

Se recomienda un MOI inferior a cuatro. Comience por sembrar las células que se van a infectar en una placa de seis pocillos con una fluidez de 30 a 40% y cultive durante la noche. Al día siguiente.

Reemplace el medio con un mililitro de medio fresco que contenga policerebro o protamina. Luego agregue entre uno y 2 millones de ui. Lentivirus que contiene un marcador fluorescente o antibiótico.

Agite lentamente el plato durante 10 segundos para mezclarlo e incubarlo durante seis horas. Después de seis horas, reemplace el medio con un medio normal y completo y propague las células durante dos días. Los medios no deben contener antibióticos o inductores, independientemente del lentivirus utilizado, después de dos días.

Añadir el antibiótico adecuado si el lentivirus contiene un marcador antibiótico. Del mismo modo, añadir inductor a la mitad de los cultivos si el lentivirus es inducible. Después de cultivar las células durante dos o tres días más con antibióticos e inductores, se realiza un análisis de sangre occidental para probar la eliminación del gen objetivo antes de los ojos de tripsina con xenoinjerto.

Las células de grandes placas de cultivo celular y las resuspenden en un medio original que contiene un 50% de matrigel. Es fundamental mantener las células cancerosas resuspendidas y en un 50%matrigel y la jeringa en hielo. De lo contrario, existe el riesgo de que la matrigel se solidifique y la infección tenga que hacer AB al respecto.

Prepare el sitio quirúrgico limpiándolo a fondo con etanol al 70% y realice la anestesia con excelente ventilación y un filtro eliminador de flúor adjunto a la cámara de inducción. Anestesiar a ratones tímicos desnudos usando 2% de flúor mezclado con 1,5% de oxígeno de tres a cinco minutos antes de la inoculación celular. A continuación, mantener la anestesia utilizando un 2% de flúor mezclado con oxígeno a través de un cono nasal.

Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica configurada a 30 grados centígrados. Cargue las células en jeringas con agujas de calibre 25 y medio para inyecciones subcutáneas, o agujas de calibre 28 a 30 para inyecciones ortotópicas. Cinco minutos después de la inducción de la anestesia en uno o dos sitios, inyecte de uno a 10 millones de células en bolos de 200 microlitros.

El número de células depende de la malignidad o agresividad de las células cancerosas. Para los vectores constitutivamente activos, utilice dos grupos de ratones inyectados con las células que expresan el gen objetivo S-H-R-N-A o un fortet S-H-R-N-A codificado en los vectores. Utilice los mismos dos grupos y divídalos cada uno en subgrupos que sean o no inductores en su agua.

Reemplace los documentos que contienen agua dos veces por semana. Controlar el volumen de los tumores semanal o quincenalmente con un C. Asegúrese de que el volumen del tumor no exceda el límite institucional o A CUC y eutanasiar a cualquier animal que muestre ulceración extensa, necrosis, infección obvia, sangrado incontrolado o enfermedad en etapa terminal. Para monitorear el crecimiento tumoral y la metástasis a través de un marcador bioluminiscente, desinfecte el área de trabajo y anestesie a los ratones en una cámara de imágenes con anestesia gaseosa.

Primero, haga una exposición de dos a cinco minutos y verifique la intensidad de la señal y luego ajústela en consecuencia. Si el tamaño del tumor supera los 1000 milímetros cúbicos o el límite de tamaño institucional, se debe sacrificar al animal en el momento del sacrificio, documentar el tamaño del tumor y conservarlo para su posterior análisis. Este protocolo se utilizó para estudiar los efectos de la formación tumoral de xenoinjerto en células de adenocarcinoma de mama humano implantadas en ratones atímicos desnudos.

Se probaron la secuencia objetivo S-H-R-N-A humana YY one y un control codificado S-H-R-N-A, que no tenía similitud significativa con ninguna transcripción humana conocida. Como resultado, se construyeron dos vectores lentivirales y se utilizaron para producir dos lentivirus. Ambos se utilizaron para infectar dos poblaciones celulares diferentes y se obtuvieron poblaciones de células policlonales.

Después de la selección de purmicina. Los análisis de sangre occidentales confirmaron que el SD indujo YY one knockdown en estas líneas celulares infectadas. A continuación, la población de células policlonales del clon tres que se infectó con YY one inducible S-H-R-N-A y el control. S-H-R-N-A.

Los LENTIVIRUS se utilizaron para probar los efectos de la depleción de YY one en la invasión. Observamos que la depleción de YY one redujo la invasividad de las células. El análisis de sangre occidental confirmó que los documentos indujeron YY un silenciamiento en las células con el indu YY uno S-H-R-N-A, mientras que las células que contienen el control.

S-H-R-N-A no mostró este efecto. Estas células se utilizaron luego en un estudio de modelo de ratón con xenoinjertos en comparación con los grupos de control indu, YY un ratón implantado S-H-R-N-A suministrado con el dos que contenía agua mostró una formación tumoral significativamente reducida cuando se visualizó por bioluminiscencia y cuando se midieron los pesos tumorales como se esperaba. YY: Un silenciamiento en estos tumores de xenoinjerto se confirmó fácilmente mediante Western blot.

Estudios: No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso, de acuerdo con las consideraciones de seguridad del NIHB, para la investigación con vectores lentivirales, se requieren procedimientos de contención de nivel de seguridad B mejorados dos para todos los entornos de laboratorio.