Oligopeptidlerin Gaz fazlı asitliğe belirlenmesi

1Department of Chemistry, University of the Pacific
Published 6/24/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Sistein içeren oligopeptidlerin gaz-fazlı asitliğe belirlenmesi açıklanmaktadır. Deneyler, bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Peptidlerin göreli asitliğe çarpışma ile indüklenen ayrışma deneyleri kullanılarak ölçülür ve kantitatif asitliğe genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntem kullanılarak belirlenir.

Cite this Article

Copy Citation

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Katlanmış proteinler farklı pozisyonlarda bulunan amino asit kalıntılarının çoğu asitliğe farklı derecelerde gösterirler. Örneğin, bir helezon N-ucunda veya yakınında bulunan bir sistein kalıntısı genellikle C-terminaline 1-6 ya da yakınında daha fazla asidiktir. Peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar sulu çözeltiler 6-8 özellikle yoğunlaştırılmış aşamasında, yürütülen olmasına rağmen, sonuçlar genellikle çözücü etkisi 7 tarafından karmaşıktır. Aslında, protein aktif bölgelerin en çözücü etkisi 9,10 kısılmış iç bölümü yakınında bulunmaktadır. Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmalar yapmak için önemlidir.

Bu gaz-fazında oligopeptidlerin asitliğe ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bir sistein ihtiva eden oligopeptid Ala, 3 CysNH kullanmak 3 CH). Ölçümler köklü uzatılmış Aşçılar kinetik yöntem (Şekil 1) 11-16 dayanmaktadır. Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı (Şekil 2) ile ara yüzey bağlantısı bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi ile gerçekleştirilmektedir. Her bir peptid örneği için, birçok referans asit seçilir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip yapısal olarak benzer organik bileşiklerdir. Peptid ve bir referans asit karışımı içindeki bir çözeltisi, kütle spektrometresi içine dahil edilir ve peptid-referans asidin bir gaz fazlı proton-bağlı anyonik kümesi oluşturulur. Proton bağlı küme kitle izole ve daha sonra çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) deney ile parçalanır. Ortaya çıkan parça iyon bolluğu asitliğe ve küme iyon ayrışma kinetik arasında bir ilişki kullanılarak analiz edilmektedir. Peptidin gaz fazı asitliği sonra obtai olduğutermo-kinetik araziler 17,18 doğrusal regresyonu ile Ned.

Yöntem, organik bileşikler, amino asitler ve bunların türevleri, oligonükleotitler ve oligopeptitler gibi moleküler sistemlerin, çeşitli uygulanabilir. Farklı düzenleyicilerin için hesaplanan bu değerlere ile deneysel olarak ölçülen gaz-fazlı asitliğe karşılaştırarak, asitliğe ilgili yapısal etkileri değerlendirilebilir.

Introduction

Amino asit kalıntılarının asitliğe yapıları etkileyen en önemli özellikleri termokimyasal, reaktiflik ve protein 9,19 arasında katlama açılımı işlemler arasında bulunmaktadır. Tek tek amino asit kalıntıları, genellikle protein konumlarını bağlı olarak farklı etkin asitliğe göstermektedir. Özellikle, aktif siteler bulunan artıkları, çoğu zaman önemli ölçüde sergileyen asitliğe tedirgin. Böyle bir örnek, enzimler 20,21 tioredoksin süper-ailesinin aktif yerleri bulunan sistein kalıntısıdır. Aktif bölge sistin proteinleri 3-5 katlanmamış kıyasla alışılmadık asidiktir. Bu sarmal yapı olağandışı asitlik önemli bir katkı olabileceği öne sürülmüştür. Özellikle sulu çözeltiler 2,6-8 yılında, çözümler yürütülen peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar vardır. Sonuçlar genellikle çözücü etkisi ile komplike edildi7. Aslında, protein, aktif siteye çözücü etkisi en aza indirilmiştir 9,10 İç bölge yakınında bulunmaktadır.

Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmaları yürütmek için önemlidir. Burada gaz-fazlı asitlik belirlenmesi için kütle spektrometri tabanlı bir yöntemi geliştirmektir. Bu yaklaşım, genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntemi olarak adlandırılır. Bu yöntem, başarılı bir şekilde, örneğin, gaz-fazı asitliği, proton afinitesi, metal iyon afinite, elektron afinite ile bağlanır ve iyonizasyon enerjisi 11-15 gibi çeşitli termokimyasal özellikleri, belirlenmesi için kimyasal sistemleri geniş bir uygulanmış 22-26. Biz, Oligo sistein polialanin ve sistein polyglycine peptidler 17,18,27 bir dizi gaz-fazlı asitliğe belirlemek için bu yöntemi uyguladık. Bu çalışmalar, N-terminal sistein peptidi olduğunu göstermektedirES karşılık gelen C-terminal olanlardan önemli ölçüde daha fazla asidik. Birincisinin yüksek asitliğe olasılıkla tiyolat anyonu güçlü bir sarmal makro-dipol ile etkileşimi tarafından stabilize edildiği sarmal konformasyon etkilerine bağlıdır. Çünkü peptidlerin uçucu olmayan ve termal kararsız doğanın, kinetik yöntemi peptidler 28 makul doğru asit-baz termokimyasal miktarlarda üretmek için şu anda mevcut en pratik yaklaşımdır.

Genel şeması ve kinetik yöntemi ile ilişkili denklemi Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir peptidin gaz-fazlı asit belirlenmesi (AH) proton bağlı küme anyonlar, bir dizi oluşumu ile başlar, [A • H • A i] ¯ (veya [A ¯ • H + • Bir alıstırma] ¯), kütle spektrometresi, iyon kaynağı bölgede, burada A ve A, ¯ alıstırma peptidin deprotone formları vesırasıyla referans asitleri içerir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip organik bileşiklerdir. Referans asitler (ancak, bir peptidin edilene benzer zorunlu değildir) birbirine benzer yapılara sahip olmalıdır. Referans asitler arasındaki yapıların benzerlik aralarında deprotanasyon entropileri benzerlik sağlar. Proton bağlı küme anyon karşılık gelen monomerik anyon elde etmek için çarpışma indüklenen ayrışma (CID) deneyleri kullanılarak kitle seçilir ve çarpışmalar ile aktive edilir ve daha sonra ayrışmış, A ve A, ¯ alıstırma, k ve k hız sabitleri i, sırasıyla, Şekil 1a'da gösterilen ile. İkinci fragmentasyon ihmal edilebilir düzeyde ise, CID fragmanı iyonların bolluk oranı, [A ¯] / [A i ¯], hız sabiti k / k i oranı yaklaşık bir yaklaşımı temsil eder. Hiçbir ters aktive olduğunu varsayımı altındaHer iki kanal ayrışma, oranlar dallanma CID ürün iyon iyon engeller, ln [¯] / [A i ¯], doğrusal gaz-fazlı peptid asit (Δ asit H) ve kişilerce ilişkili olacaktır referans asitleri (Δ asit H I), Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bu denklemde, Δ asit H ort referans asitlerin ortalama gaz fazı asitliği olan, Δ (Δ S) entropi terimi (referans asitler yapısal olarak birbirine benzer ise sabit kabul edilebilir olan), R evrensel gaz sabitidir ve T eff sisteminin etkili bir şekilde sıcaklığıdır. Etkin sıcaklık çarpışma enerjisi de dahil olmak üzere bir çok deneysel değişkenlere bağlıdır, ampirik bir parametredir.

Gaz-fazlı asitlik değeri, termo-kinetik araziler iki set yapımında tarafından belirlenir. Ilk seti ob olanLN işaretlenmesiyle tained ([A ¯] / [A i ¯]) Δ asit H I karşı - Δ asit H ort, Şekil 4a'da gösterildiği. Doğrusal regresyon Y X = 1 / RT eff ve yakaladığını eteklerinde düz çizgiler bir dizi verecektir = - [Δ asit H - Δ asit H ort] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Parsellerin ikinci seti, Şekil 4b'de gösterildiği gibi, karşılık gelen eğimli karşı ilk grubu (X) 'dan elde edilen yakalar (E) çizilmesi ile elde edilir. Δ asit H avg ve Δ (Δ S) / R bir yolunu kesmek - Doğrusal regresyon Δ asit H bir eğimle yeni bir satır üretir. Δ asit H değeri, daha sonra eğiminden elde edilir ve entropi terimi, Δ (Δ S) elde edilirkesmek.

Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı ile ara-yüzeyi üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresinin şematik diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. CID deneyler ilk kuadruple kitle birimi ile proton bağlı küme anyonlar seçilmesini ve yaklaşık 0.5 mTorr basıncında tutulur çarpışma odasının içine sızan argon atomu ile çarpışmaları geçmesi için izin vererek gerçekleştirilir. Ayrışma ürün iyonları kütle üçüncü kuadrupol ünitesi ile analiz edilmiştir. CID spektrumları tüm olası ikincil parçaları kapsayacak kadar geniş m / z aralığı ile çeşitli çarpışma enerjileri kaydedilir. CID ürün iyon yoğunlukları tarama seçilen ürünün iyonları odaklı olduğu seçilen reaksiyon izleme (SRM) modunda cihaz ayarı ile ölçülür. CID deneylere tekabül, dört farklı çarpışma enerjileri gerçekleştirilirsırasıyla 1.0, 1.5, 2.0, ve 2.5 eV, merkezi-of-kütle enerji (E cm). Merkezi bölgesinin kütle enerjisi denklem kullanılarak hesaplanır: E = E cm laboratuar [m / san (M + m)], D laboratuar laboratuar çerçeve içinde çarpışma enerjisi, m argon kütlesi ve M Proton bağlı küme iyon kütlesi.

Bu yazıda, model bileşik olarak oligopeptid Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) kullanın. C-terminali amide edilen ve sistein tortusuna ait tiol grubu (SH), asidik sitesi olacaktır. Uygun bir referans asitlerin seçimi gaz-fazlı asitlik başarılı bir ölçüm için çok önemlidir. İdeal referans asit yapısal olarak benzer olan (birbirlerine) köklü bir gaz-fazı asidite değeri, organik bileşikler. Referans asit peptidler olduğu kadar yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Peptid, bir 3 CH için, altı carboxyli halojenlenmişC asitler, referans asitler olarak seçilmiştir. Altı referans asitler kloroasetik asit (MCAH), bromoasetik asit (mbah), difluoroasetik asit (DFAH), dikloroasetik asit (DCAH), dibromoacetic asit (DBAH) ve trifluoroasetik (TFAH) vardır. Bunlardan ikisi, DFAH ve mbah, protokol göstermek için kullanılacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Örnek Çözeltisinin Hazırlanması

  1. Üretim peptidin stok çözeltileri ve 1:1 hacim oranında metanol ve suyun oluşturduğu karışık bir çözücü kullanılarak altı referans asit hazırlamaktadır. Stok çözeltileri, yaklaşık 10 -3 M arasında bir konsantrasyonda olması gerekir
  2. 1.5 ml Eppendorf tüp Katı peptid örneği, 1 mg, 3 CH, tartılır ve metanol ve su karışımı bir çözücü 1.0 ml ve bir vorteks ile karıştırın.
  3. Difluoroasetik asit (DFAH), 1 mg tartılır ve metanol ve su karışımı bir çözücü 1.0 ml ve bir vorteks ile karıştırın.
  4. Diğer beş referans asitler kloroasetik asit (MCAH), bromoasetik asit (Mbah), dikloroasetik asit (DCAH), dibromoacetic asit (DBAH) ve trifloroasetik asit (TFAH) için stok çözümler yapmak için aynı prosedürü kullanın.
  5. 1.5 ml lik Eppendorf tüpüne peptid stok solüsyonu yaklaşık 50 ul sistemi ve sa içine DFAH arasında stok solüsyonu yaklaşık 50 ul çizmekBeni Eppendorf tüp. Yaklaşık 10 -4 M bir son konsantrasyon elde etmek için metanol ve su karışımı bir çözücü 900 ul ile karışık çözeltisi ile seyreltilir Bu seyreltilmiş çözelti kütle spektrometresi ölçümleri için numune çözeltisi olarak kullanılır. Referans asit yanı sıra örnek çözeltinin nihai konsantrasyona peptid gerçek oranı, kütle spektrometresi, iyon gözlenen sinyal miktarlara göre ayarlanacaktır.
  6. Diğer beş referans asitler ile peptid numunesi çözeltilerin hazırlanması için aynı prosedürü kullanarak.

2. Kütle Spektrometre Ölçüm 1: Proton bağlı Küme İyon Oluşumu

  1. Kütle spektrometrisi ölçüm ilk adım, bir referans asit ile peptidin stabil proton bağlı küme iyonları üretmektir.
  2. -4.5 KV ESI iğne voltajı ile negatif iyon modunda, MS, yaklaşık -35 V ve kapiler voltajı ve kurutma gazı sıcaklığı alet setinin150 ° C 'de muhafaza Q1 pik genişliği ve Q3 pik genişliğini ayarlamak hem kalibre ölçekli (en tepe genişliği doruklarına çözünürlüğünü ayarlamak için kullanılabilecek bir araç parametredir. "Kalibre ölçeği" ayarı iyi tepe ayrılması için dar zirveleri görüntülemenize olanak sağlar .) Kılcal voltaj ve kurutma gazı sıcaklığı gözlenen iyon bollukları geliştirmek için ayarlanabilir.
  3. 1 ml Hamilton şırınga içine peptid-DFAH bir örnek solüsyon 0.5 ml aşılamak ve PEEK boru kullanarak ESI iğne girişine şırınga bağlayın. Daha sonra şırınga pompası üzerine şırınga. 10 ul / dak akış hızı ile ESI iğne içine örnek solüsyonu aşılamak için şırınga pompası açın.
  4. ESI işlemi etkinleştirmek için ESI iğne gerilim açın. Dedektör açın. Bir kütle spektrum ekran profil modunda dikkat edilmelidir. Ekran ağırlık merkezi modunda ise, profil moduna geçin. Audiomonitoring tarafından proton bağlı küme iyon oluşumu izleng m / z 428 de zirve. Küme iyonu sinyal bolluğu ince ayar cihazı tarafından ayarlanabilir. Önemli bir parametre, kılcal gerilimidir. Bir el m / z 428 Â'da doruk bolluğu en üst düzeye çıkarmak için (tipik olarak -20 ila -50 V aralığında) ve kapiler voltajı değiştirebilir.

3. Kütle Spektrometre Ölçüm 2: CID çıkışı Deneyleri

  1. Bir sonraki adım CID braketi deneme yapmaktır.
  2. Küme iyon bolluğu istediğiniz değeri (100 mV civarında) ulaştığında, MS / MS moduna araç geçiş. Bu modda, kütle analizi olarak küme iyonu, çarpışma hücre olarak Q2 fonksiyonlar ve Q3 fonksiyonları izole etmek için bir filtre kütlesi olarak S1 fonksiyonları.
  3. Çarpışma gaz (argon, bu durumda) 0.5 mTorr basınç ve 17 eV çarpışma enerji ayarlayın. Üç tepe kitle spektrumu ekran penceresinde dikkat edilmelidir. M / z 428 de zirve küme iyon, [karşılıkDFA • H • A 3 CS] ¯. M / z 332 ve m / z 95 ° C'de iki tepe sırasıyla deprotone peptit (3 CS ¯) ile deprotone difluoroasetik asit (DFA ¯) karşılık gelir. M / z 298 ikincil tepe deprotone peptid ikincil bir fragmanıdır. 2 dk, Şekil 3a için CID spektrum edinin.
  4. Benzer CID deneyler ve bromoasetik asit (mbah), Şekil 3b, bir peptide örnek solüsyonu için bir CID spektrumu kazanır.
  5. Benzer CID deneyleri ve diğer tüm referans asitler ile peptid numunesi çözeltiler için CID spektrumu kazanır. Elde edilen CID spektrumu Şekiller 3a ve 3b, niteliksel olarak benzer olacaktır, ancak m / z değerleri ve nispi zirve yüksekliklerinin farklı olacaktır.

4. Kütle Spektrometre Ölçüm 3: Kinetik Yöntemi

  1. Son adım SRM spektrumları edinmektir.
  2. Ağırlık merkezi için spektrum ekran geçiş ve seçilen reaksiyon izleme (SRM) moduna cihazı ayarlayın. Ilk dört kutuplu (Q1) tarafından izole iyon olarak m / z 428 tutmak ve üçüncü dört kutuplu (Q3) tarafından izlenecek dört kitleler (kütle-to-ücret oranları) doldurun. Dört kütleleri m / z 428 (küme iyonu), m / z 332 (peptid iyonu), m / z 298 (peptid iyonunun fragmanı), m / z 95 (DFA ¯ iyon) vardır. 0.5 mTorr de çarpışma gaz basıncı tutun.
  3. 11.7 eV çarpışma enerji ayarlayın ve 5 dakika boyunca spektrumları elde.
  4. 17.6 eV çarpışma enerji değiştirin ve 5 dakika boyunca spektrumları elde.
  5. 23.4 eV ve 29.3 eV çarpışma enerji değiştirin ve 5 dakika boyunca çarpışma enerjileri hem de spektrumları elde.
  6. Diğer tüm referans asitler, peptid için benzer ölçümlerle gerçekleştirin.

5. Veri Analizi

  1. Al iyon yoğunluğu değerlerini kopyalaExcel çalışma sayfası üzerine l SRM spektrumları.
  2. CID ürün iyon dallanma oranları hesaplayın, ln ([A ¯] / [A i ¯]), dört çarpışma enerjileri de altı proton bağlı kümeler için ölçülen. Örnek değerleri Tablo 1 'de gösterilmiştir.
  3. Ln değerleri arsa ([A ¯] / [A i ¯]) Δ asit H i değerlerine karşı - Δ asit H ort. Bu dört çarpışma enerjileri, Şekil 4a'da verilere karşılık gelen dört araziler verecektir.
  4. Dört araziler lineer regresyon tarafından yamaçları ve yakaladığını değerlerini ayıklayın. Bu durumda, eğimli pozitif değerler ve yakaladığını negatif değerler bulunmaktadır. Sembolü yamaçları "X" ve sembolü "Y" yakaladığını verin. Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmiştir. -1 Ile Y değerlerini çarpın ve (bu dis y ekseni sağlar pozitif değerleri temsil için sembol Y 'kullanın) pozitif değerler oynar. Not, bu dönüşümü karşılık gelen değerleri bir sonraki aşama için çizim yapmak için kullanılabilir olduğu sürece, isteğe bağlı olarak.
  5. X, Şekil 4b değerlerine karşı Y 'değerleri çizilir. Arsa lineer regresyon 1.706 bir eğim ve -0,536 bir yolunu kesmek verir. Δ asit H ort - eğim Δ asit H karşılık gelir. Δ asit H avg değeri seçilen referans asit grubu tarafından belirlenir 330.5 kcal / mol olduğu bilinmektedir. Peptidin gaz-fazlı asitlik değeri, daha sonra eğiminden elde edilir: H Δ asit (A 3 CH) = 332.2 kcal / mol '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. CID braketi deneyler seçilen referans asitlere göre peptid göreli asitliğe hakkında bilgi verir. Iki referans asitler, DFAH ve mbah ile peptit (3 CH) iki temsilci CID spektrumu, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Şekil 3A'da peptid iyonunun iyon bolluk (tepe yükseklik) DFA bu ¯ ve Şekil 3b'de, peptid iyon, iyon bolluğu MBA ¯ göre daha güçlü olan daha zayıftır. İki tayf peptidin gaz-fazlı asit, bu iki referans asitlerin asitliğe aralığında olduğunu göstermektedir.
  2. Peptidin gaz-fazlı asitlik değeri nicel kantitatif CID deneylerde tespit edilir. Altı referans asit, peptid, proton bağlı kümelerin ayrışma termo-kinetik grafikleri Şekil 4 'de gösterilmiştir. Termo-kinetik relati göre araziler lineer regresyongaz-fazlı asit ve CID ürün iyon dallanma oranı (Şekil 1b) arasında öğrenmekten yararlanma peptid 332.2 kcal / mol olan bir 3 CH, ve gaz-fazı asitlik değeri verir. Eğim ve Sabit örnek değerleri Tablo 1 ve 2'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntem genel şeması a.) Proton bağlı küme iyon ayrışma düzeni. Gaz-fazlı asitliğe ve dallanma oranının CID ürün iyon arasında b) termo-kinetik ilişkisi. Bu denklemde, Δ asit H I özel referans asitlerinin gaz-fazlı asitlik değeri, Δ asit H ort is aReferans asitlerin verage gaz fazı asitliği, Δ asit H peptid için gaz-fazı asit olup, Δ (Δ S) entropi terim, R, evrensel gaz sabitidir ve T eff sisteminin etkili bir şekilde sıcaklığıdır .

Şekil 2,
Şekil 2. Bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi. ESI şematik bir çizimidir elektrosprey iyonizasyon iyon kaynağıdır. Q1 ve Q3, sırasıyla birinci ve üçüncü kuadrupol birimini temsil eder. CID Deneme yapmadan üzerine, proton bağlı küme iyonları kitle Q1 tarafından seçilir, ve çarpışma hücre içine sızan argon (Ar) atomları ile çarpışmak için çarpışma hücre içine yönlendirilir, ve ortaya çıkan parça iyonları Q3 ile analiz edilir.

Şekil 3, Şekil 3,. Iki referans asit a) [DFA • H • A 3 C] ¯ ve b) [MBA • H • A 3 C] ¯. Spektrumları çizilen olarak göreli bir peptide bağlı proton küme iyonları için CID spektrumu m / z değeri karşı iyon bolluğu.

Şekil 4,
Şekil 4. Dört çarpışma enerjileri toplanan altı referans asitlerle peptid için termo-kinetik araziler a) Y arsa = ln ([A ¯] / [A i ¯]) karşı X = Δ asit H i -. Δ asit H ort . b) Y 'arsa = [Δ asit H - Δ asit H </ Em> ort] / RT eff - Δ (Δ S) / R X = 1 / RT eff karşı.

Tablo 1. CID ürün iyon dallanma oranı değerleri, ln ([A ¯] / [A i ¯]), DFAH ve mbah ile peptidin küme iyonları için.

HA i 11.7 eV 17.6 eV 23.4 eV 29.3 eV
MCAH 3.68 3.50 3.39 3.45
Mbah 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0,442 -0,268 -0,0921 0.167
DCAH -2.60 -2.41 -2.22 -2.13
DBAH -2.43 -2.44 -2.49 -2.60
TFAH -5.41 -5,02 -4.71 -4.44
Tablo 2'de. Yamaçları (X) değerleri ve termo-kinetik araziler ilk seti doğrusal regresyon kaynaklanan yakaladığını (Y).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir peptidin gaz-fazlı asit başarılı bir ölçüm büyük ölçüde uygun bir referans asitlerin seçimi dayanır. İdeal referans asitler köklü bir gaz-fazı asidite değeri olan yapısal olarak benzer bir organik bileşiklerdir. Referans asitler birbirinden yapısına benzer bir yapıya sahip olmalıdır. Bu dizi, referans asitlerin her biri için, deprotonasyon benzer bir entropi sağlayacaktır. Referans asit peptidlerin kişilerce yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Amidatlanmış C-terminali ile kısa sistein ihtiva eden oligopeptid için, karboksilik asitler, uygun bir referans asit, halojene. Başarılı CID deneyler doğru çok önemli bir adım yüksek bolluk ile istikrarlı proton bağlı küme iyonları oluşumudur. Stabilite ve bolluk büyük ölçüde referans asit, örnek solüsyonun konsantrasyonu ve etkili koşullar (örneğin bir iğne voltajı olarak, kurutmadan peptidin oranını ayarlamak sureti ile geliştirilebilirgazı sıcaklığı ve kılcal gerilimi). Bir çok önemli aracı kalıntıları ve kapiler voltajı (ya da araçlar arasında başka bir tür için koni voltajı,) 'dir. Bir uyarı da yoğunlaşmıştır örnek çözümleri kullanarak kaçınmaktır.

De tarif edilen yönteme oligopeptidler ile sınırlı değildir. Yöntem, polar organik bileşikler, amino asitler ve bunların türevleri, organometalik bileşikler, oligonükleotidler ve peptit-taklit eden polimerler de dahil olmak üzere moleküler sistemlerin çeşitli uygulanabilir. Üç dört kutuplu kütle spektrometresi kullanarak ek olarak, bu deney, iyon tuzak ve Q-TOF kütle spektrometresi kullanılarak ifa edilebilir.

Bu deneyde kullanılan peptit katı faz peptid sentezi 29-31 arasında standart bir yöntem kullanarak laboratuarda sentezlendi. Rink amid reçinesi amid C-terminali vermek üzere katı destek olarak kullanılmıştır. Aşçılar kinetik yöntemin avantajı, t küçük kirliliklerO peptid örnek kirleri peptidler ya da referans asitler aynı kitleler yok sürece, asitlik ölçümleri etkilememektedir.

Deneysel ölçümler asitliğe üzerindeki yapısal etkilerini incelemek için hesaplama çalışmaları ile birleştiğinde olabilir. Hesaplamalı çalışmalar, hesaplanan asitliğe maç peptidlerin konformasyonlar tahminleri sağlar. Hesaplanan değerler deneysel olarak ölçülen asitliğe karşılaştırarak, peptidlerin konformasyonlarının değerlendirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ifşa hiçbir şey.

Acknowledgements

Materials

E çarpışma, eV

X

1 / RT eff

Y

- [(Δ asit H - Δ asit H ort) / RT eff - Δ (Δ S) / R]

11.7 0,744 -0,728
17.6 0.700 -0,665
23.4 0.665 -0,611
29.3 0,645 -0,553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48, (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2, (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35, (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282, (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277, (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253, (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116, (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268, (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14, (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13, (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34, (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115, (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118, (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31, (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113, (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21, (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3, (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91, (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39, (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112, (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113, (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106, (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267, (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16, (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats