Intravaskulär perfusion av Carbon Black Ink Tillåter Pålitlig Visualisering av cerebrala kärl

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Analys av gnagare cerebrovaskulär anatomi spelar en viktig roll i experimentell strokeforskning. I detta sammanhang har intravaskulära perfusion med färgad latex ansetts som ett standardverktyg i flera år. Detta innebär dock teknik distinkta tekniska begränsningar som undergräver dess reproducerbarhet. Här beskriver vi en enkel metod för att visualisera cerebrala kärl på ett reproducerbart sätt. Injektion av en blandning av två kommersiellt tillgängliga kolsvart bläck genom den vänstra ventrikeln myokardiala resulterar i adekvat fyllning av cerebrala kärl med hög kontrast visualisering. Vi har framgångsrikt tillämpat denna teknik för att identifiera anastomotiska punkter mellan cerebrala vaskulära territorier möss med olika genetiska bakgrunder. Vi ger slutligen bevis för att denna nya och enkel metod för fartyg färgning kan kombineras med trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning - ett allmänt använt verktyg för att observera och analysera infarkt volymer i möss.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels. J. Vis. Exp. (71), e4374, doi:10.3791/4374 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den anatomiska struktur cerebrala kärl är en viktig faktor för hjärnan hemodynamik samt svårighetsgraden av skada efter ischemiska förolämpningar. Den cerebrala kärl svarar dynamiskt till olika patofysiologiska tillstånd och det uppvisar stora skillnader mellan stammar och under förhållanden med genetiska manipulationer. I huvudsak, är en pålitlig teknik för intrakraniell fartyg färgning nödvändig för att studera patogenesen för ischemisk stroke. Tills nyligen har ett antal olika tekniker som använts för att visualisera den cerebrala vaskulaturen inklusive injektion av låg viskositet harts, Araldite F, gelatin blandat med olika färgämnen 1 (dvs. karminröd, tusch) eller latex med 2 eller 3 utan kimrök. Perfusion av vit latex föreningen genom den uppåtgående aortan har först rapporterades av Coyle och Jokelainen 3. Maeda et al. 2 har ändrat protokollet genom att lägga carbon svart bläck till latex föreningen för förbättrad kontrast visualisering av kärlen efter saltlösning perfusion av hjärnan. Emellertid ineffektiva perfusion och otillräcklig fyllning av fartygen ofta upplevt på grund av hög viskositet av latex föreningen 4. Därför har vi beskrivit en enkel och kostnadseffektiv teknik som använder en blandning av två kommersiellt tillgängliga kolsvart bläck (CB1 och CB2) att visualisera den cerebrala vaskulaturen på ett reproducerbart sätt 5. Vi har visat att perfusion med CB1 + CB2 i möss resulterar i färgning av betydligt mindre cerebrala kärl vid en högre densitet i jämförelse med latex perfusion 5. Här beskriver vi vår protokoll för att identifiera de anastomotiska punkter mellan den främre (ACA) och mellersta cerebrala artärer (MCA) för att studera fartyg variationer i möss med olika genetiska bakgrunder. Slutligen visar vi genomförbarheten av vår teknik i en övergående fokal cerebral ischemi hos möss genom att kombinera CB1 +CB2-medierad kärl färgning med TTC färgning i olika grader av ischemiska skador.

Protocol

1. Djur

  1. Experiment utfördes i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och godkänd av lokala myndigheter. För alla experiment, C57BL6 / J vildtypmöss, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) och SV129 möss (12-16 veckor gamla, 26-30 g kroppsvikt, 5-6 djur per experimentgrupp) användes.

2. Färgning av cerebrala kärl med färgad latex

  1. Förbered en blandning av 25 | il kolsvart bläck (Herlitz, Tyskland) med 0,5 ml latex förening (Pebeo, Frankrike) vid en 1:20-förhållande i en EP rör och värma upp blandningen vid 37 ° C i ett vattenbad. Samla blandningen i en 2 ml spruta med en nål av 28-30G innan bedövande djuret.
  2. Lös 50 mg papavarine hydroklorid pulver i 1 ml steril normal saltlösning. Samla lösningen i en insulinspruta. Bryt av nålen från en annan steril insulinspruta. Placera denna nål vid slutet av en 20 Cm lång PE10 rör. Nu bifoga denna PE10 rör på nålen av insulin spruta innehållande papavarine hydrokloridlösning att injiceras genom lårbensvenen att säkerställa vasodilatation och korrekt fyllning av fartyg.
  3. Bered ytterligare två insulinsprutor vardera innehållande 1 ml saltlösning. Insulinsprutor tillåter smidig leverans av den injicerade vätskan vid en exakt position. Bör dock på grund av hög viskositet latex, alternativ 1 ml sprutor med löstagbara bredare nålar användas.
  4. Ta alla sprutor och steriliserade dissekera instrument nära den operativa skede. Sprid en kirurgisk klädeshandlare ark runt skede av driften. Operationen steget bör vara tillräckligt upplyst och operationsmikroskop får användas vid behov.
  5. Nu mäta kroppsvikten hos en C57BL6 / J-mus och sedan inducera anestesi med 5% isofluran förångas i 70% N 2 O och 30% O 2. Fortsätt anestesi med 1% av förångad isofluran. Efter ordentlig POSITIONSBg av musen på dess rygg och fixering av lemmarna, bedöma djupet av anestesi. Sedan skära huden över den vänstra femorala venen och lokalisera venen. Sätt den vassa spetsen på nålen placerad på PE10 rör och långsamt injicera papavarine hydroklorid lösning med en hastighet av 100 pl per minut (50 mg / kg kroppsvikt).
  6. Efter injektionen, skär bukhålan och genomborrar membranet. Skär revbenen att exponera hjärtat utan att skada eller blåmärken det. Fäst nedåtgående torakala aortan med en artär pincett. Gör en kraftig minskning över höger förmak för att tillåta det venösa blodet rinna ut. Injicera 2 ml saltlösning i vänstra ventrikeln, följt av insprutning av färgad latex manuellt med lätt tryck över 18-20 sek. Använd de förfyllda sprutor efter varandra. Undvik att injicera eventuella bubblor.
  7. Efter injektion av latex, lämnar djuret under 5 minuter. Halshugga djuret och ta försiktigt bort hela hjärnan. Ta väl hand inte att skada kärlet arkitektur och corteX när du tar bort skallbenet och hjärnhinnorna. Placera hjärnan i en 60 mm cellodling skål innehållande 6-8 ml 4% PFA att ta ett foto. Placera en mätning härskare under genomskinliga skålen. Ta bilder på en 25x förstoring av den dorsala och den ventrala ytan av hjärnan med en kamera fäst vid operationsmikroskop. Foton bör tas på 90 ° vinkel mellan petriskål och mikroskopet målet för att kvantifiera den ursprungliga avståndet.
  8. Upprepa proceduren i ytterligare 4-5 djur.

3. Färgning av cerebrala kärl med blandning av kolsvart bläck

  1. För att jämföra resultatet av latex baserad cerebral vaskulär färgning med vår protokoll, förbereda en blandning av 100 pl Herlitz Stempelfarbe bläck (CB1) med 900 pl Pelican Scribtol Schwarz bläck (CB2) i en 1,5 ml EP rör. Bered två EP rör för att göra en total volym av 2 ml blandning av CB1 och CB2 i en 1:9 förhållande. Samla blandningen i två separata insulinsprutor (1ml vardera). Förslut sprutorna och placera dem i ett vattenbad för att värma upp till 37 ° C. Samla 2 ml saltlösning i ytterligare två insulinsprutor, och placera dem i ett vattenbad också.
  2. Söva djuret och upprepa samma procedur som beskrivits ovan med undantag för injektion av papavarine hydroklorid. Efter injektion av 2 ml salaine in i den vänstra ventrikeln, injicera en 2 ml blandning av kimrök bläck istället för färgad latex. Utför injektioner för hand med lätt tryck över 18-20 sekunder per ml. Fäst nedåtgående aorta före injektionerna.
  3. Offra djur, ta bort hjärnan och ta bilder.
  4. För långsiktigt bevarande av hjärnan, sätta hjärnan i 4% PFA över natten följt av inkubering med sackaros med gradvis ökande koncentration tills den flytande hjärnan submerges helt (5% följt av 15% och därefter 30%). Hjärnor av djuren perfunderade med den färgade latexen kan också bevaras på samma sätt.
  5. Utförförfarande i ytterligare 4-5 djur. För att jämföra skillnaden i cerebral vaskulär anatomi på grund av olika genetisk bakgrund eller stammar, upprepa protokollet i lika många ApoE KO och SV129 möss, respektive.
  6. För att studera den vaskulära anatomin i ischemiska förhållanden framkalla övergående fokal cerebral ischemi under 45 min eller 90 min enligt ett standardprotokoll för intraluminal ocklusion av MCA under djup anestesi (en detaljerad beskrivning av operationen är utanför ramen för denna artikel, den hänvisas läsaren till Doeppner et al. 2010). I slutet av reperfusionsperioden planerade (1 dag eller 5 dagar), utför den vaskulära färgning med CB1 + CB2 bläck endast och fläckar hela hjärnan med 2% TTC-lösning vid 37 ° C under 5-10 minuter för att identifiera infarktvolymen . TTC reduceras till röd formazan av mitokondriella enzymer (särskilt succinatdehydrogenas). Efter TTC färgning, de metaboliskt aktiv vävnad fläckar djupt rött när infarkt vävnaden förblir unstaiNed och är vit på grund dysfunktionella och denaturerade mitokondriella enzymet. Samla bilder på samma sätt som beskrivits ovan.

4. Studie av cerebrala vaskulära områdena

  1. För att analysera brutto anatomi cerebrala kärl, bilder på den dorsala ytan av hjärnan antingen färgas med färgad latex eller CB1 + CB2 bläck kan analyseras med ImageJ programvara (en Java-baserad allmänt tillgänglig programvara som används för bildbehandling och analys). Hjärnor perfunderade med färgad latex kan visa varierande grader av fartygets färgning belägen på den övre delen, medan CB1 + CB2 perfusion färgar alla fartyg både ventrala och dorsala ytor.
  2. Öppna en bildfil med ImageJ programvara. Identifiera alla anastomotiska punkter mellan ACA och MCA. En anastomotiskt punkten definieras som den plats där fartyget diameter är den smalaste eller halva avståndet mellan de närmaste förgrenade punkterna i ACA och MCA grenar, respektive 2.
  3. Ställ skalan i mm. Mät avståndet mellan anastomotisk linjen och mittlinjen vid 4 mm kaudalt främre polen i hjärnan med hjälp raka verktyg linje ritning och "åtgärd" verktyg. Gör samma sak på 6 mm kaudalt från den främre stolpen. Analysera 3-4 bilder per djur och beräkna medelvärdet. Jämför värdena mellan olika grupper av djur för att identifiera variationer i cerebrovaskulär anatomi. Under C57BL6 / J-djur, kan det anastomotiska linjen mellan ACA och MCA spåras närmare mittlinjen vid 4 mm än vid 6 mm kaudalt från den främre stolpen. ApoE KO-möss kommer att presentera någon signifikant skillnad i detta avseende. Tvärtom, i SV129 möss anastomotisk linjen kommer att ligga längre och parallellt med mittlinjen både vid 4 mm och 6 mm kaudalt från den främre polen.
  4. För att analysera den vaskulära anatomin in ischemiska förhållanden, utför samma beräkningar som nämns ovan. Identifiera infarkt gränsen som de röda och vita färg vävnad marginal som representerar metaboliskt aktiv vävnad och nekrotisk ofärgade vävnader, respektive. Mät avståndet av infarkten gränsen från mittlinjen vid 4 mm och 6 mm kaudalt från den främre polen på hjärnan. Samla medelvärdet från 3 till 4 bilder per djur. Jämför resultaten mellan olika ischemi och perioder reperfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här övervinner de tekniska begränsningarna hos konventionella latexbaserad visualisering av gnagare cerebral kärl. Figur 1A visar att efter perfusion av färgade latex, bara de stora fartyg på ventrala ytan är färgade, lämnar hela dorsala ytan ofärgade. Resultatet är också mycket varierande. Endast ett djur av sex visar partiell färgning av ACA och MCA synliga på den dorsala ytan av hjärnan (data visas ej). Omvänt CB1 + CB2 perfusion leder tillräckligt fyllning av både små och stora fartyg i ett jämlikt sätt (Figur 1B). Färgningen är stabil tills 7 dagar utan någon förändring av kvalitet. Använda ImageJ program har vi kvantifierade avståndet mellan anastomotiska punkter mellan ACA och MCA från mittlinjen i vildtyp C57BL6 / J möss (figur 1C). Vi jämförde dessa värden med ApoE KO-möss för att observera huruvida den genetiska modificatipå hade någon effekt på den regionala vaskulär anatomi (figur 1D). Även knackar ur ApoE påverkade inte den anatomiska struktur cerebrala kärl i C57BL6 / J möss sågs en ​​signifikant skillnad märkte mellan C57BL/6J och SV129 stammar (Figur 1E, F). Sålunda, kan vi visa genomförbarheten av detta färgningsprotokollet att utvärdera de anatomiska skillnaderna i den cerebrala vaskulaturen grund genetiska eller stam skillnader i möss.

I experimentella modeller gnagare stroke är TTC färgning används ofta för att observera infarkt volym. Samtidig visualisering av cerebrala kärl och infarkt volym ger oss möjlighet att analysera morfologiska förändringar efter ischemi-reperfusion. Därför har vi konstaterat huruvida CB1 + CB2-medierad vaskulär färgning var stabil med TTC färgning i olika grader av ischemisk-reperfusionsskador (Figur 2A-H). Vi har vidare analyserat anastomotisk punkter mellan ACA och MCA efter 45 min eller 90 min för ischemi matchas med antingen 1 dag eller 5 dagar reperfusion perioder (Figur I, J). Som väntat visade den genomsnittliga avståndet mellan mittlinjen och anastomotiska punkterna ingen signifikant skillnad mellan grupperna (figur 2i, J) och var i samma storleksordning med icke-ischemiska djur (Figur 1F). Emellertid skilde avståndet från mittlinjen till infarkten gränsen betydligt, vilket avspeglar den ökade infarkt volym med högre grad av ischemi-reperfusionsskada (Figur 2K, L). Dessa data visar att CB1 + CB2 färgning kan reproduceras i djur som utsätts för olika grad av ischemi-reperfusion skada och stabiliteten i färgning i kombination med TTC färgning.

374/4374fig1.jpg "/>
Figur 1. Observation av cerebrala vaskulära anatomin hos möss med genetiska och stam skillnader. Figur 1A visar att intravaskulär perfusion av färgade latex endast fläckar stora fartyg på den ventrala ytan, medan den dorsala ytan förblir ofärgade. Omvänt CB1 + CB2 perfusion resulterar i permanent färgning av både små och stora fartyg på ventrala och dorsala ytor i hjärnan (Figur 1B). Kvantifiering av avståndet mellan anastomotiska punkter mellan främre cerebrala artären (ACA) och den mellersta cerebrala artären (MCA) från mittlinjen i vildtyp C57BL6 / J-möss (figur 1C) visar ingen skillnad med sina genetiskt mutanta ApoE KO motsvarigheter (Fig. 1D). Dock signifikant skillnad märkt mellan C57BL6 / J och SV129 stammar (Figur 1E, F). Skalstock = 2mm. * Signifikant skild från både C57BL6 / J vildtyp och ApoE KO-möss vid 4mm, s. p <0,01.

Figur 2
Figur 2. Analys av vaskulär anatomi i ischemiska hjärnor. Figur 2A-H visar bilder av de ventrala och dorsala ytor hjärnan utsätts för 45 min eller 90 min ischemi följt av 1 dag eller 5 dagar reperfusion tid. Den vänstra panelen visar CB1 + CB2 medierad vaskulär färgning, medan den högra panelen visar en kombination av både den vaskulära färgning och TTC färgning, vilket indikerar stabilitet vaskulära färgning i olika grader av ischemisk-reperfusionsskador (Figur 2A-H). Analys av anastomotiska punkter mellan främre cerebrala artären (ACA) och den mellersta cerebrala artären (MCA) efter 45 min eller 90 min ischemi matchas med antingen 1 dag eller 5 dagar reperfusionsperioden dePicts ingen signifikant skillnad mellan grupperna (figur 2i J). Emellertid kan signifikant skillnad noteras i avståndet från mittlinjen till infarkten gränsen, indikerar ökningen av infarkt volym med högre grad av ischemi-reperfusionsskada (Figur 2K, L). Skala stapel = 2 mm. * Signifikant skild från 45 min ischemi med 1 dag reperfusion, p <0,05, och ** 5 dagar reperfusion, p <0,01. Klicka här för att se större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Perfusion av CB1 + CB2 genom manuell injektion kan utföras framgångsrikt av utan intensiv träning, eftersom det inte innebär någon specifik enhet innebära visst tryck 2,3. Heterogenitet perfusion resultat i vår protokollet är också försumbar. Endast 1 djur av 16 icke-ischemiska djur och 3 av 20 ischemiska djur har visat ofullständig perfusion. I dessa fall, var införlivandet av bubblor under saltlösning perfusion leder till ocklusion av fartyg sannolikt orsaken till det misslyckade resultatet.

Även perfusion av latex har ursprungligen gjorts genom stigande aorta 2,3, alternativa vägar för perfusion också redovisas inklusive den vänstra kammaren 7,8 eller den gemensamma halspulsådern 9. Vi hittade ingen signifikant skillnad i utfall efter perfusionen genom antingen den uppstigande aorta eller vänster kammare (opublicerade observationer). Som sådan var det senarevalts på grund av dess lättare tillgänglighet.

Innan du väljer de specifika kolsvart bläck nämns i denna studie, har vi utvärderat resultaten av intravaskulär perfusion med en rad kommersiellt tillgängliga kolsvart bläck. CB1 och CB2 är utvalda för sin perfusion effektivitet och stabilitet färgning. CB1 har en mycket låg viskositet (1,1 mPa / sek) innehållande 2,1% kolsvart medan CB2 - ursprungligen tillverkades som ett kalligrafibläck - innehåller 2,5% kolsvart med en högre viskositet (10-50 mPa / s). Individuell tillämpning av dessa bläck har befunnits vara otillräckliga när det gäller både effektivitet och stabilitet färgning. Följaktligen har vi kombinerat blacken och titrerades kombinationen förhållandena. Perfusion med CB1: CB2 på en 1:9 förhållande resulterar i permanent färgning av både stora och små fartyg. Därför kan arteriella anastomotiska poäng lätt spåras för att definiera korsningen mellan två vaskulära territorier, dvs. ACA och MCA. Dessa findings överensstämmer med tidigare rapporter 2,10,11.

ApoE KO möss presenterar 5-8 gånger högre plasma-kolesterol och är mycket mottagliga för att utveckla åderförkalkning när de sätts på kolesterol rik kost 12. Huruvida den genetiska modifieringen påverkar också anatomi cerebrala kärl har inte rapporterats ännu. Å andra sidan, är SV129 möss redan rapporterats att presentera större infarkt volym i jämförelse med C57BL6 / J-möss på grund av deras olika vaskulär anatomi 2. Vi kontrollerade vår protokoll i dessa tre grupper av djur för att jämföra skillnaden i vaskulär anatomi.

För att validera färgningsprotokollet i ischemiska hjärnor, engagerade vi övergående fokal cerebral ischemi att inkludera effekter av reperfusion i motsats till tidigare studier, som främst fokuserade på permanent ocklusion av MCA 2-4, 10,13. Som väntat, vi observerar inte några betydande skillnader i mönstret av Line av anastomos efter olika ischemiska och reperfusion perioder C57BL6 / J möss. Inga förändringar i fartygens diameter mellan ischemiska och icke-ischemiska halvklot observerades, förmodligen sådana förändringar sker vid längre reperfusion gånger, dvs 2-3 veckor efter stroke 14. Sammanfattningsvis, är protokollet framgår av oss mindre komplicerat, kostnadseffektiv teknik som lätt kan reproduceras i jämförelse med konventionell latexbaserad perfusion att visualisera cerebral kärl. Det kan betraktas som ett effektivt verktyg för att analysera brutto anatomi cerebrala kärl och vaskulära områden i olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Genom att kombinera med TTC färgning denna teknik ger en ny möjlighet att identifiera omfattningen av en ischemisk skada i samband med vaskulära utbudet zoner i hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi vill tacka Britta Kaltwasser för hennes utmärkta tekniskt bistånd och Mahesh Kumar Teli att organisera förberedelserna videofilmning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scribtol Schwarz (CB2) Pelican, Germany 221 135
Stempelfarbe (CB1) Herlitz PBS AG, Germany 10417202
Gedeo Latex Pebeo, France 13042B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, H., Peng, Y., et al. Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries. Brain Research. 1261, 75-81 (2009).
  2. Maeda, K., Hata, R., et al. Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice. Neuroreport. 9, (7), 1317-1319 (1998).
  3. Coyle, P., Jokelainen, P. T. Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat. The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).
  4. Coyle, P. Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY). The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).
  5. Hasan, M. R., Herz, J., et al. Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy—A new and reliable technique in mice. Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).
  6. Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).
  7. Todo, K., Kitagawa, K., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion. Stroke. 39, (6), 1875-1882 (2008).
  8. Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke. Stroke. 42, (3), 770-775 (2011).
  9. Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. Arteriogenesis in hypoperfused rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23, (5), 621-628 (2003).
  10. Maeda, K., Hata, R., et al. Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion. in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).
  11. Wang, Y., Kilic, E., et al. VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena. Brain. 128, (1), 52-63 (2005).
  12. ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation. Stroke. 42, (2011).
  13. Coyle, P., Jokelainen, P. T. Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats. Stroke. 14, 605-611 (1983).
  14. Coyle, P. Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat. The Anatomical Record. 210, (2), 357-364 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics