Imaging Analyse af Neuron til glia Interaktion i Mikrofluid Kultur Platform (MCP)-baseret Neuronal Axon og glia Co-kultur System

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denne undersøgelse beskriver procedurerne for at oprette en ny neuronal axon og (astro) glia co-kultur platform. I dette co-kultursystem, bliver manipulation af direkte interaktion mellem en enkelt axon (og enkelt gliacelle) mulig, således mekanistisk analyse af den gensidige neuron til gliale signalering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Higashimori, H., Yang, Y. Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System. J. Vis. Exp. (68), e4448, doi:10.3791/4448 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Korrekt neuron at glia interaktion er kritisk for fysiologiske funktion af centralnervesystemet (CNS). Denne tovejskommunikation er sofistikerede medieret af specifikke signalveje mellem neuron og glia 1,2. Identifikation og karakterisering af disse signalveje er afgørende for forståelsen af, hvordan neuron til glia interaktion figurer CNS fysiologi. Tidligere har neuron-og glia blandede kulturer været almindeligt anvendt til afprøvning og karakterisering af signalveje mellem neuron-og glia. Hvad vi har lært af disse præparater og andre in vivo værktøjer har dog foreslået, at de gensidige signalering mellem neuron og glia ofte forekom i specifikke rum i neuroner (dvs. axon, dendritceller, eller soma) 3. Det gør det vigtigt at udvikle en ny kultur, der tillader adskillelse af neuronale rum og specifikt undersøger samspillet mellem glia og neuronale axoner / dendritter. Endvidere er den konventionelle blandede kultursystem ikke individualisere de opløselige faktorer og direkte membran kontaktsignaler mellem neuron-og glia. Det store antal neuroner og gliaceller i den konventionelle co-kultur-systemet mangler opløsningen nødvendigt at observere interaktionen mellem en enkelt axon og en gliacelle.

I denne undersøgelse beskriver vi en hidtil ukendt axon-og glia co-dyrkningssystem med anvendelse af en mikrofluid kultur platform (MCP). I dette co-kultursystem er neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre, der er forbundet gennem flere centrale kanaler. I denne microfluidic kultur platform, kan der kun neuronale processer (især axoner) indtast den glial side gennem de centrale kanaler. I kombination med kraftige fluorescerende protein mærkning, tillader dette system direkte undersøgelse af signalveje mellem axonale / dendritisk og glial interaktioner, sådans axon-transkriptionel regulering i glia, glia-medieret receptor handel i neuronale terminaler, og glia-medierede Axon vækst. Den snævre diameter af kammeret også signifikant forbyder strømmen af ​​neuron-beriget medium ind i glia kammer, lette probning af den direkte membran-protein-interaktion mellem axoner / dendritter og glial overflader.

Protocol

1. Montering af Mikrofluid Kultur Afdeling (MCP)

  1. MCP (fig. 1) er åbne kamre konstrueret til rumopdelt kulturer af forskellige typer af celler 4. Det har typisk to rum, der er forbundet gennem de centrale kanaler (3 um i diameter). Montering af MCP med glas-bund retter er nødvendig for at udarbejde kulturer og efterfølgende billedbehandling analyse.
  2. Dels coat sterile glas-bund retter med polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) opløst i natriumtetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) og blev inkuberet natten over ved 37 ° C.
  3. Den følgende dag blev de coatede glas-bund retter vasket tre gange med ddH 2 O og tørret under sterile stinkskabet. Glasset bund retter blev derefter yderligere coatet med laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) og tørret under UV-lys i 1 time. Overtrukne skåle er klar til brug eller kan lagres ved -20 ° C indtil anvendelse. Disse coating are nødvendig for plettering neuroner og astrocytter i co-kultur.
  4. For at samle kultur platform blev mikrofluide kultur platforme anbragt oven på de overtrukne glas-bund retter med centrale forbindende kanaler på sin underside for at danne en tæt forsegling. Regelmæssig neuron eller astrocyt dyrkningsmedier blev tilsat (fra Celleudpladning områder) på begge sider (fig. 1) i den samlede MCP og inkuberet i 2-4 timer ved 37 ° C, for at sikre mod lækage mellem MCP og glas- rundbundet skål. Vi har testet med medium før udpladning af celler for at sikre mod lækage. Samlingen af ​​MCP på glas bund fad bør tilberedes umiddelbart foer brug.

2. Udarbejdelse af Neuronal Kultur og Induktion af neuronale axoner i Assembled MCP

  1. Corticale neuronale cellekulturer blev frisk fremstillet af embryoniske 14 til 16 dage gamle mus hjerner. Neuron dyrkningsmedium er sammensat af Neurobasal medium, 2% B27 neurobasal tillæg, 2 mM glutamin ved tilsætning af 1% af 100x Glutamax, og 1% penicillin-streptomysin. Efter dissektion af musehjernen blev meninges fjernet fra cortex under dissektionsmikroskop. Vævet blev derefter hakket med et barberblad til at foretage små vævsblokke for at øge det overfladeareal udsat for trypsin. Vævsblokke blev trypsinbehandlet (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsin) i 10 minutter i et 37 ° C vandbad, og derefter dissocieret forsigtigt ved triturering med en flammepoleret Pasteur-pipette. Dissocierede celler blev filtreret gennem en 70 pm si til at indsamle klart neuronal cellesuspension.
  2. Neuroner (2-3 x 10 6 / ml, 150 pl) blev udpladet på de Celleudpladning områder på højre side (fig. 1) af den samlede MCP således at neuroner kan vedhæfte i cellen retentionsområde (figur 1). Frisk fremstillede neuroner blev udpladet med neuron plademedium, som er suppleret med 5% kalvefosterserum (Hyclone) i reguleringenr neuron dyrkningsmedium. Fordi kun de neuroner, der lægger i cellen retentionsområde er i stand til at vokse axoner i den anden side af den samlede MCP gennem centrale kanaler, er det vigtigt at pladen høj tæthed af neuroner i cellens plating område for at sikre nok neuroner er fastgjort til celle retentionsområde. Et repræsentativt billede af høj tæthed af neuronale axoner er vist i figur 2A.
  3. Den følgende dag blev neuron plademedium erstattes med regelmæssige neuron dyrkningsmediet. Ændring af medium blev udført ved omhyggelig opsugning mediet fra cellen plating område af kammeret, men ikke fra cellen retentionsområde af den samlede MCP, for at undgå luftbobler i cellen retentionsområde og den centrale forbindende kanaler. Luftbobler vil alvorligt hæmme Axon udvækst og efterfølgende adgang til de centrale kanaler i MCP. Glia-celle afledt neurotrofisk faktor (GDNF, 10-20 ng / ml) blev også tilsat til den anden (venstre) sideaf kammeret samme dag for at lette induktionen af axon-udvækst 5 fra den neuronale side og tværs gennem centrale kanaler i den samlede MCP (figur 2A). Rimelig mængde spontan neuritudvækst uden GDNF er også observeret i det neuronale side og tværs gennem centrale kanaler i den samlede MCP. Axoner, der indgår i den centrale kanal er ofte observeret 2-3 dage efter udpladning. Når axonerne træder ind i den centrale kanal, de sædvanligvis til den anden side inden for en dag. Axoner er normalt intakt i mindst en uge efter at indtaste den anden side.

3. Tilsætning af Dyrkede Astrocytes til MCP at oprette en ruminddelt Co-kultur System

Primære astrocyt-kulturer blev fremstillet ud fra P1-3 mus pup hjernen. Hjernen dissociation Proceduren svarer til den neuronale celleisolering ovenfor beskrevne procedure. Astrocytter blev først udpladet i 10 cm skål, der blev præ-Overtrukket med polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Den astrocyt dyrkningsmedium (DMEM, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomysin) blev ændret hver dag for de næste to dage for at fjerne debris. Derefter blev mediet skiftet hver tredje dag.

  1. Astrocytter bliver 90% konfluente og danne et monolag efter 7 dage. Sammenflydende astrocytter blev trypsinbehandlet og 150 pi resuspenderede astrocytter (1x10 6 / ml) blev igen udpladet i cellen plating område af den venstre side af den samlede MCP når axoner er på vej ind, eller er netop indgået i venstre side af den samlede MCP. Astrocytter blev normalt udpladet 4-5 dage efter neuroner var forgyldt. GDNF blev først fjernes, før fornyet udpladning af astrocytter i den venstre side af MCP. Re-belagte astrocytter blev fastgjort i cellen retentionsområde, som det fremgår af GFAP immunofarvning (figur 1). Kun minimal strøm af medium mellem begge sider af kamrene (bestemt ved fluorescens dja) blev fundet i MCP, som tidligere vist 4,6.
  2. Astrocytter bliver 90% konfluente og danne et monolag efter 7 dage. Sammenflydende astrocytter blev trypsinbehandlet og 150 pi resuspenderede astrocytter (1 x 10 6 / ml) blev igen udpladet i cellen plating område af den venstre side af den samlede MCP når axoner er på vej ind, eller har netop indgået venstre side af den samlede MCP. Astrocytter blev normalt udpladet 4-5 dage efter neuroner var forgyldt. GDNF blev først fjernes, før fornyet udpladning af astrocytter i den venstre side af MCP. Re-belagte astrocytter blev fastgjort i cellen retentionsområde, som det fremgår af GFAP immunofarvning (figur 1). Kun minimal strøm af medium mellem begge sider af kamrene (bestemt ved fluorescens farvestoffer) blev fundet i MCP, som tidligere vist 4,6.
  3. Efter fornyet udpladning af astrocytter direkte axoner der kom ind i venstre side af den samlede MCP interagere med astrocytes ved enten direkte axonal kontakt eller frigivelse af opløselige faktorer. Immunfarvning af astroglial plasmamembran glutamat transportør GLT1 og neuronal βIII-tubulin blev udført for at visualisere interaktionen mellem axonerne og astrocytter, som vist i figur 2D-F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Time-lapse imaging analyse af axon-induceret GLT1 promotoraktivering i astrocytter

Den rumopdelt neuron og astrocyt co-kultur system tillader kun de neuronale processer, især de axoner, til selektivt at interagere med astrocytter. Efter den vellykkede etablering af axon-og astrocyt (eller andre glialceller) co-kultur i den samlede MCP, kan forskellige typer af axon-glia vekselvirkninger undersøges såsom, axon-induceret aktivering af astroglial genpromotor aktivering, astrocyt-induceret axon vejledning , axon-induceret astroglial Ca2 +-respons, og axon-induceret myelin syntese i oligodendrocytter. Alle disse applikationer drage fordel af tilgængeligheden af ​​magtfulde fluorescerende reportere til rådighed for gliaceller eller farvestoffer lastet til disse celler.

Her beskriver vi axon-induceret transkriptionel aktivering af astroglial glutamat transporter 1 (GLT1)-promotor ved at anvende bakterielle kunstige chromonogle (BAC) GLT1 eGFP transgene mus og denne ruminddelt co-kultursystem. I BAC GLT1 eGFP transgene mus, blev en eGFP fluorescens reporter overudtrykkes under kontrol af den GLT1 genomiske promotor 7. Ekspressionen af EGFP reporter korrelerer med endogent GLT1 promotoraktivering proteinekspression og funktionel aktivitet 7 således tillader en vurdering af GLT1 promotoraktivitet i enkelte astrocytter in situ. Astroglial GLT1 ekspression er stærkt afhængig af neuronal stimulering 6,8. Primære astrocytter udtrykker minimumsniveauer for GLT1, men er GLT1 ekspressionsniveauer (både mRNA og protein) kraftigt induceret i astrocytter, der dyrkes sammen med neuroner 9. Beviserne er her vist med signifikant forøget GLT1 immunoreaktivitet i ruminddelt co-kultursystem (fig. 3). I konventionel neuron og astrocyt co-kulturer med høj densitet af neuroner gør det mindre ideelt at observerevirkning af neuronale axoner på transkriptionel aktivering af GLT1 promotoren.

Til overvågning af axon-afhængige GLT1 promotoraktivering, vildtype neuroner blev dyrket i højre side af den samlede MCP og axoner blev induceret efter anvendelsen af ​​GDNF på venstre side af den samlede MCP. Astrocytter afledt af BAC GLT1 eGFP mus blev dyrket i venstre side af den samlede MCP efter axoner er blevet induceret og blot indført i venstre side af den samlede MCP. I alt 6 dage (24 timer til 140 timer) time-lapse billeder opsamledes for at overvåge eGFP fluorescensintensitet ændres i realtid og Axon vækst i MCP. Som vist i figur 4A, var meget minimale eGFP fluorescens ekspression i astrocytter observeret 24 timer efter udpladning af astrocytter. Betydelig forøgelse af eGFP intensitet blev observeret 48 timer efter co-kultur (fra 24 timer til 68 timer), når axoner er godt ind i det astrocyt side og interaktiont direkte kontakt med astrocytter (Figur 4 f.Kr.). På den anden side var eGFP fluorescensintensitet gradvis faldet når axoner blev tilbagetrukket og degenereret af kainite (200 uM) induceret neuronal celledød i neuronale (højre) side af den samlede MCP (figur 4D-F). Den dynamiske ændring af EGFP fluorescensintensitet som reaktion på axonerne viste klart, at astroglial GLT1 promotoraktiviteten moduleres af Axon interaktion.

Figur 1
Figur 1. Skematisk diagram af mikrofluid neuron og astrocyt co-kultur platform. Mikrofluid kultur platform (MCP) har to rum, der er forbundet gennem de centrale kanaler. Celler kan udplades fra cellen plating område på hver side og neuronale axoner induceres fra cellen retentionsområde og passerer gennem de centrale kanaler til entare den anden side (indsæt skala bar 50 um).

Figur 2
Figur 2. Induktion af neuronale axoner og interaktion af axoner med astrocyt i MCP MCP. (A) høj tæthed af neuroner i cellens retentionsområde af den samlede MCP, fremgår af βIII-tubulin immunfarvning. Scale bar: 50 pm (B) forstørret billede af axoner krydser de centrale kanaler og indgår i den anden side af MCP. Scale bar: 100 um (C) Axon vækst kegle afsløret af BIII-tubulin-farvning, når axoner ind i den anden side af MCP. Scale bar: 100 um (D) Axon bundter, der vokser gennem den centrale kanal og træde ind i den anden side af MCP. (E) Astrocytes afsløret af GLT1 immunfarvning i glia side af MCP. (F) Fusioneret billede viser kontakt mellem axoner og GLT1 positive astrocytter. Scale bar: 50 pm.


Figur 3. Neuron-afhængig induktion af GLT1 ekspression i primære astrocytter GLT1 immunoreaktivitet i (A) primære astrocyt kulturer, Scale bar:. 50 um (B) primære neuronale kulturer, og (C) primær neuron og astrocyt co-kulturer. Scale bar: Neuroner er vist ved immunfarvning af βIII-tubulin. Signifikant stigning i GLT1 immunreaktivitet blev observeret i neuron og astrocyt co-kulturer.

Figur 4
Figur 4. Time-lapse billeder af axon-induceret GLT1 promotoraktivering i MCP med BAC GLT1 eGFP astrocytter og vildtypemus neuroner. Dynamiske ændringer af EGFP intensitet og væksten af axoner blev indsamlet gennem et 6d tidsforskudt optagelse efter astrocyt plating. (A) 24H (B) 48h (C) 68h (D) 92H (E) 112H (F) 140H. Indtastning af enXons (fremhævet af de gule pile) ind i astrocyt side blev observeret fra 48 timer til 92h, som korrelerer med øget eGFP fluorescensintensitet. Falde af EGFP fluorescensintensitet opstod fra 112H til 140H efter kainite (200 uM) blev påført på den neuronale side ved 92h at inducere neuronal celledød og Axon degeneration. Scale bar: 50 pm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MCP baserede neuron og astrocytter co-kultur system tillader dissektion af detaljerede neuron til astroglia signalveje ved kun at tillade axonerne passerer de centrale kanaler og interaktion med astrogliale celler. Denne co-kultursystem kan hensigtsmæssigt konfigureres med konventionelle neuron og astrocyt kultur procedurer. Vi beskrev også en praktisk anvendelse af denne co-kultur ved at ansætte en eGFP baseret reporter for at demonstrere axon-afhængig GLT1 promotoraktivering i astrocytter.

Denne MCP baserede neuron og astroglia co-kultur systemet tilbyder flere fordele sammenlignet med konventionelle co-kultur metoder: 1) evne til at visualisere og identificere den eksplicitte morfologiske samspil mellem enkelte axoner og astrocytter i real-time under høj opløsning mikroskopi 2) en brønd styret uafhængigt mikromiljø til at anvende farmakologisk manipulation for cellespecifik effekt 3) analyse af promotor-aktiveringog proteinekspression udelukkende induceres / opreguleret i astrocytter der er moduleret ved axoner kontakt. Som kultur-procedurerne for den primære microglia 10 og oligodendrocytter 11 er blevet veletableret, kan denne MCP co-kultursystem også anvendes på neuron til microglia og neuron til oligodendrocyt co-kulturer. I mellemtiden har vi også anerkende, at denne co-kultursystem er beregnet til følsomme billedanalyse på enkeltcelle-niveau, som er komplementært til de konventionelle fremgangsmåder til analyse af store mængder af celler, såsom RNA eller protein analyse. Desuden forenkler vores system den enorme interaktion mellem neuroner og gliaceller in vivo gennem eksemplificerende interaktion mellem encellede og axon. Alle disse bør overvejes, når fortolkningen af ​​resultaterne fra denne co-kultur-systemet. I CNS, er interaktioner mellem axoner og forskellige gliaceller bredt til stede og er af afgørende betydning for både neuron oggliøse funktioner 12,13. Udvikling af denne co-kultur-system vil gøre det muligt imaging-baserede dissektion af disse interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Jeffrey Rothstein for at give BAC GLT1 eGFP mus og GLT1 antistof, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) til at give værdifulde core faciliteter, New fakultet rekruttering tilskud (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts Neuroscience afdeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum Hyclone SH30070.03 for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F4135 for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor R&D Systems 212-GD Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose Sigma-Aldrich 11995
70 mm cell strainer BD Falcon 352350
Sterile glass bottom dish MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms Xona Microfluidics LLC SND150
6 wells of the culture plate Cellstar 657 160

Neuron culture medium

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin

Neuron culture medium for plating cell

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
  • 5% Fetal bovine serum SH30070.03

Astrocyte culture medium

  • Dulbecco modified eagle medium high glucose
  • 10% Fetal bovine serum F4135
  • 1% Penicillin-streptomysin

Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
  2. Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
  3. Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
  4. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
  5. Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
  6. Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
  7. Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
  8. Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
  9. Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
  10. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
  11. Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics