एक एम्फ़िबियाई रेटिना स्लाइस तैयारी में photoreceptors और दूसरा आदेश न्यूरॉन्स से एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग

Neuroscience
 

Summary

हम जलीय बाघ सैलामैंडर (से पतली रेटिना स्लाइस की तैयारी का वर्णन

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Van Hook, M. J., Thoreson, W. B. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007, doi:10.3791/50007 (2013).

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Abstract

Protocol

1. रेटिना स्लाइस तैयारी

  1. चैम्बर (डिजाइन चित्रा 1 में सचित्र) इकट्ठे. जगह वैक्यूम तेल के दो मोती, superfusate के लिए एक चैनल के लिए फार्म और रेटिना स्लाइस एम्बेड करने में जो रिकॉर्डिंग कक्ष में अलग से स्थान दिया गया ~ 8-10 मिमी,. एक सेतु और सीमा spillover के रूप में कार्य करने के लिए कुछ मिलीमीटर आगे बाहर तेल के इन दो मोतियों की प्रत्येक परे तेल का एक दूसरा मनका जोड़ें. संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ तरल पदार्थ संपर्क सुनिश्चित करने के चैम्बर के अंत में KimWipe के एक छोटे से त्रिकोणीय टुकड़ा रखें.
  2. वैक्यूम तेल के दो छोटे मोतियों में कांच खुर्दबीन स्लाइड के खिलाफ फ्लैट, nitrocellulose झिल्ली (0.8 सुक्ष्ममापी pores ~ 5 x 10 मिमी) का एक टुकड़ा दबाएँ. इस पालन से रेटिना रोका जा सकता है के रूप में करने से बचें, nitrocellulose झिल्ली के केंद्र के नीचे सीधे तेल डाल.
  3. ऊतक slicer तैयार करने के लिए, 4 टुकड़ों में एक डबल धार रेज़र ब्लेड तोड़ने और टुकड़ा करने की क्रिया हाथ करने के लिए एक देते हैं. Nitrocellul की एक पतली टुकड़ा कटose झिल्ली रेजर ब्लेड की धार रिकार्डिंग कक्ष के खिलाफ फ्लैट देता है और इसलिए nitrocellulose झिल्ली के माध्यम से सफाई से कि कटौती सुनिश्चित करने के लिए.
  4. विच्छेदन स्टेशन पर बर्फ पर उभयचर नमकीन घोल (1 टेबल) के एक छोटे से बीकर रखें.
  5. कत्ल करके समन्दर euthanize. रीढ़ की हड्डी के माध्यम से sagitally सिर और मज्जा Hemisect. कपास के एक टुकड़े पर सिर की जगह आधा लिनोलियम ब्लॉक के ऊपर उभयचर खारा के साथ सिक्त. सिर के दूसरे आधे दिन में बाद में उपयोग के लिए एक नम कागज तौलिया के साथ लिपटे और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  6. आंख साफ करना. छोटे Vannas कैंची का प्रयोग, आसपास के कक्षा के लिए आंख जोड़ने त्वचा में कटौती. आसपास के कक्षीय ऊतक से आंख के सामने मुक्त कराने के बाद, कक्षा से आंख को मुक्त, आंख की मांसपेशियों और ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से कटौती करने के लिए आंखों के नीचे कैंची आगे आंख खींचने और स्लाइड.
  7. पर कपास की एक बिस्तर पर enucleated आंख रखेंलिनोलियम ब्लॉक. आधे सिर त्यागें. आँख के पीछे से अतिरिक्त कक्षीय वसा ट्रिम.
  8. एक तेज सर्जिकल ब्लेड से कॉर्निया के बीच में एक छोटा सा चीरा. चीरा में ठीक Vannas कैंची फिसलने और ora serrata ओर त्रिज्यात कटौती बाहर का विस्तार से कॉर्निया निकालें. लिनोलियम ब्लॉक या कटौती के बीच कपास घूर्णन द्वारा ora serrata आसपास circumferentially काटें.
  9. आंख के आसपास सभी तरह काटने के बाद, eyecup की ओर से उन्हें बाहर खींच कर कॉर्निया और लेंस को हटा दें. लिनोलियम ब्लॉक के एक कठिन सतह पर जिसके परिणामस्वरूप eyecup हटो उभयचर खारा समाधान के साथ सिक्त. आप श्वेतपटल के माध्यम से सभी तरह से काट दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक ठीक काटने का कार्य गति का उपयोग करते हुए, एक तेज धार के साथ तिहाई में यह कटौती.
  10. रेटिना की सतह के साथ nitrocellulose झिल्ली पर eyecup की जगह एक या दो टुकड़े नीचे का सामना करना पड़. डूब अतिरिक्त नमक के साथ शेष टुकड़े और ~ 4 ​​डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में उन्हें जगह
  11. जीईntly ठीक संदंश के साथ nitrocellulose झिल्ली के खिलाफ eyecup का टुकड़ा दबाएँ. रेटिना पालन करने के लिए मदद करने के लिए KimWipe साथ किनारों पर ठंड उभयचर खारा और दाग के कई बूंदों के साथ डूब nitrocellulose झिल्ली और eyecup टुकड़ा. ठंड उभयचर खारा समाधान और छील दूर (कारण कड़ा rhodopsin की उपस्थिति को गुलाबी प्रकट हो सकते हैं) रेटिना को अलग करने के श्वेतपटल / रंजित / रेटिना वर्णक उपकला के कई बूंदों के साथ एक बार फिर, डूब eyecup और nitrocellulose झिल्ली. यदि आवश्यक हो, रेटिना मुक्त करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका कटौती.
  12. रेटिना मजबूती से पालन नहीं किया है, nitrocellulose झिल्ली पर अधिक मजबूती से नीचे रेटिना खींचने के लिए एक KimWipe साथ खारा दूर नाली. खारा बदलें. यदि आवश्यक हो तो, दोहराएँ.
  13. ठंड उभयचर खारा के साथ चैम्बर भरें और ऊतक slicer की अवस्था को हस्तांतरण. Vernier माइक्रोमीटर बदल कर अन्य को एक सिरे से काम करने, पतली स्ट्रिप्स में रेटिना और nitrocellulose झिल्ली स्लाइस125 माइक्रोन वेतन वृद्धि में. धीरे लेकिन मजबूती से रेटिना और nitrocellulose झिल्ली के माध्यम से धार दबाएं.
  14. रिकार्डिंग कक्ष के मुख्य चैनल में nitrocellulose झिल्ली की स्ट्रिप्स ले जाकर रेटिना स्लाइस स्थानांतरण. मुक्त झिल्ली की एक स्ट्रिप लिफ्ट और फिर स्लाइस जलमग्न रखने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है, इसे नीचे चैम्बर बढ़ रहा है जबकि यह जगह में पकड़. रेटिना परतों को देखने के लिए उन्हें 90 डिग्री घूर्णन, वैक्यूम तेल की स्ट्रिप्स में nitrocellulose झिल्ली के किनारों को शामिल करें.
  15. कांच की सतह के खिलाफ nitrocellulose झिल्ली फ्लैट दबाएं. हर टुकड़ा पर रेटिना वहाँ नहीं है, भले ही सतह तनाव को तोड़ने में मदद मिलेगी और द्रव प्रवाह में सुधार करने के लिए छिड़काव चैनल की पूरी लंबाई के साथ नियमित अंतराल (अलग ~ 1 मिमी) पर nitrocellulose झिल्ली की जगह स्ट्रिप्स.

2. बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग

  1. स्लाइस के सभी स्थानांतरित कर दिया गया है, निश्चित, एक ईमानदार के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष चालमंच माइक्रोस्कोप और संदर्भ इलेक्ट्रोड नेतृत्व देते हैं. एक लंबे समय से काम कर रहे दूरी, पानी विसर्जन, 40-60X उद्देश्य का उपयोग स्लाइस पर ध्यान दें. खुर्दबीन कंपन गीला हो जाना एक हवाई मेज पर रख दिया गया और बिजली के हस्तक्षेप को कम करने के लिए एक फैराडे पिंजरे में रखा जाना चाहिए.
  2. 100% 2 हे के साथ bubbled उभयचर नमकीन घोल के साथ 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से लगातार स्लाइस Superfuse. प्रवाह और बहिर्वाह संतुलित कर रहे हैं, यकीन है कि मद्यपान से कनेक्ट करें. बहना शोषण सुई के beveled अंत घूर्णन द्वारा या करीब या दूर दूर बहिर्वाह सुई से चैम्बर के अंत में KimWipe हिल द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. तैयारी कमरे के तापमान पर रखा है या एक Peltier डिवाइस के साथ या बस खुर्दबीन मंच पर एक आइस पैक की स्थापना करके ठंडा किया जा सकता.
  3. मंद या बुनियादी लाल बत्ती के तहत स्लाइस की जांच करने और कोशिकाओं की एक जोड़ी की पहचान - पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित करने के लिए - एक फोटोरिसेप्टर (छड़ी या शंकु) और आसपास क्षैतिज या द्विध्रुवी सेल. छड़ मैं हो सकता हैउनके बड़े सेल निकायों और प्रमुख छड़ी की तरह बाहरी क्षेत्रों (2A चित्रा) द्वारा dentified. शंकु छड़ से छोटे हैं और छोटे पतली बाहरी क्षेत्रों है. द्विध्रुवी सेल और क्षैतिज सेल SOMAS भीतर परमाणु परत में सेल शरीर की सबसे बाहरी पंक्ति (; आंकड़े 2B और 2C लीग) में हैं.
  4. स्लाइस की तैयारी से पहले, borosilicate ग्लास (1.2 मिमी बाहरी व्यास, एक गिलास फिलामेंट के साथ 0.95 मिमी भीतरी व्यास) से micropipettes निर्माण करने के लिए एक विंदुक खींचने का उपयोग करें. प्रत्येक micropipette की नोक व्यास में ~ 1-2 माइक्रोन होना चाहिए.
  5. एक गैर धातु भरने सुई (जैसे एक एक 1 सीसी सिरिंज या एक MICROFIL से निर्मित) का उपयोग करना, intracellular समाधान (1 टेबल) के साथ pipettes भरने और इलेक्ट्रोड धारक को देते हैं.
  6. थोड़ा खुर्दबीन उद्देश्य तरक्की. उद्देश्य नीचे फोटोरिसेप्टर पिपेट स्थित करें और फिर टिप सिर्फ स्लाइस ऊपर तैनात है इतना है कि यह कम है. टी के साथ दोहराएँवह दूसरे पिपेट.
  7. एम्पलीफायर पर आधारभूत मौजूदा स्तर में ऑफसेट किसी समायोजित करें. एक 5-10 एम वी depolarizing नाड़ी के साथ पिपेट प्रतिरोध की जाँच करें. आम तौर पर हम pipettes का उपयोग करने वाले MΩ 10-15 से लेकर, शाफ्ट और उभयचर विंदुक समाधान के कम परासारिता की लंबी घटना का नतीजा है. उच्च परासारिता स्तनधारी समाधान के साथ, ये वही pipettes MΩ ~ 8-12 के प्रतिरोध मूल्यों दिखा रहे हैं. हम 3-4 MΩ उभयचर समाधान के प्रतिरोध मूल्यों के साथ बड़ा टिप व्यास का इस्तेमाल किया है, जबकि एक कम उपयोग प्रतिरोध द्वारा प्रदान की फायदे कोशिका झिल्ली पर सीलिंग में एक बड़ी कठिनाई और कैल्शियम धाराओं और अन्य दूसरे दूत का एक और अधिक तेजी से ठहरनेवाला से भरपाई कर रहे हैं संवेदनशील प्रतिक्रियाओं.
  8. मामूली सकारात्मक दबाव, स्थिति के बाद synaptic पिपेट आवेदन करते समय यह संपर्कों क्षैतिज या द्विध्रुवी सेल शरीर इतना है कि. फिर presynaptic पिपेट की स्थिति यह संपर्कों एक छड़ी या कोन फोटोरिसेप्टर की सेल शरीर इतना है कि. रिकॉर्डिंग appeविंदुक युक्तियाँ बल्कि सोमा से आंतरिक खंड संपर्क जब गिरफ्तारी विशेष रूप से शंकु में, अधिक स्थिर हो.
  9. प्रतिरोध की निगरानी करते हैं, बाद synaptic पिपेट पर सकारात्मक दबाव जारी है. कभी कभी, सकारात्मक दबाव के रिलीज के एक gigaohm मुहर फार्म के लिए पर्याप्त है. यदि नहीं, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ या मुंह से कोमल चूषण लागू होते हैं. टिप प्रतिरोध MΩ> 100 हो गई है के बाद, -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता लागू होते हैं. एक gigaohm मुहर प्राप्त करने के बाद, किसी भी पिपेट समाई यात्रियों बाहर अशक्त और -70 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता को लागू करने, फोटोरिसेप्टर पिपेट के लिए सीलिंग प्रक्रिया को दोहराने.
  10. टूटना अपने मुंह या बदले में प्रत्येक कक्ष के लिए चूषण लागू करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करके पैच. छड़, शंकु, और द्विध्रुवी कोशिकाओं कोमल चूषण के साथ टूटना आम तौर पर होगा. एक क्षैतिज सेल के साथ पूरे सेल विन्यास प्राप्त "जैप" च के साथ दिया मजबूत त्वरित वोल्टेज दालों के साथ संयोजन में अधिक से अधिक सक्शन (एक 3 सीसी सिरिंज के साथ अर्थात्) की आवश्यकता हो सकतीपैच दबाना एम्पलीफायर की eature. पूरे सेल विन्यास की झिल्ली और स्थापना का टूटना पूरे सेल समाई यात्रियों की उपस्थिति से स्पष्ट हो जाएगा.
  11. एक प्रकाश फ़्लैश लागू करने और 20 एम वी वेतन वृद्धि (आंकड़े 3 और 4) में -120 के लिए 40 एम वी से वोल्टेज कदम की एक श्रृंखला देने से physiologically बाद synaptic सेल की पहचान की पुष्टि करें.
  12. कोशिकाओं की जोड़ी synaptically जुड़े हुए हैं, फोटोरिसेप्टर के लिए एक संक्षिप्त (25-100 मिसे), 60 एम वी कदम विध्रुवण वितरित (-10 एम वी के लिए, एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम वर्तमान के चोटी के पास) और देखने का आकलन करने के लिए दूसरा आदेश न्यूरॉन में बाद synaptic धाराओं (चित्रा 5) के लिए. एक मजबूत depolarizing कदम कोन (चित्रा 5) से पुटिका रिहाई के एक पटाखे की वजह से बाद synaptic क्षैतिज या बंद द्विध्रुवी सेल में एक तेज, क्षणिक आवक बाद synaptic वर्तमान आह्वान करना चाहिए.

Representative Results

समन्दर रेटिना की खड़ी स्लाइस में न्यूरॉन्स से प्रकाश प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधि निशान 3 चित्र में दिखाया जाता है. कोन, क्षैतिज सेल, और द्विध्रुवी सेल बंद सभी प्रकाश शुरुआत के जवाब में एक जावक मौजूदा प्रदर्शन. क्षैतिज और द्विध्रुवी सेल रिकॉर्डिंग में प्रकाश फ्लैश निम्नलिखित प्रमुख आवक चालू वे प्रकाश ऑफसेट पर बिगाड़ना रूप photoreceptors से ग्लूटामेट की वृद्धि की रिहाई के कारण होता है. पर द्विध्रुवी सेल एक पंजीकरण inverting के metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर संकेतन झरना और TRPM1 चैनल 9 की सक्रियता से उत्पन्न प्रकाश शुरुआत में एक आवक वर्तमान के साथ प्रतिक्रिया करता है. क्षैतिज कोशिकाओं और द्विध्रुवी कोशिकाओं उनके चतुर्थ संबंधों (चित्रा 4) के द्वारा एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. द्विध्रुवी कोशिकाओं एक उच्च इनपुट प्रतिरोध किया है, जबकि, क्षैतिज कोशिकाओं को आमतौर पर एक रेखीय या अंदर की ओर चतुर्थ सुधार और कम इनपुट प्रतिरोध (चित्रा -4 ए MΩ <500) है(0.5-2 GΩ) और मैं बाहर-सुधार - वी (चित्रा 4 बी) चित्रा 5 एक शंकु के क्षैतिज सेल जोड़ी (चित्रा 5A) और शंकु के रवाना द्विध्रुवी सेल जोड़ी (चित्रा 5 ब) की रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है.. प्रत्येक में -70 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से -10 एम वी शंकु depolarizing क्षैतिज या द्विध्रुवी सेल में कोन और तेज आवक EPSC में मौजूदा एक वोल्टेज gated कैल्शियम पैदा की. इस मजबूत प्रोत्साहन ~ 47 पीए / रिबन 10 के एक EPSC में जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक अन्तर्ग्रथनी रिबन से ~ 20 vesicles के आसानी से छोड़ देने योग्य पूल, खाली करने के लिए पर्याप्त है. चित्रा 5A में क्षैतिज सेल EPSC यह presynaptic कोन से 5 रिबन संपर्क प्राप्त, सुझाव है कि 232 पीए था. बंद द्विध्रुवी सेल में 178 पीए EPSC (चित्रा 5 ब) से इसी प्रकार का एक अनुमान यह presynaptic कोन से 4 रिबन संपर्कों को प्राप्त है कि पता चलता है.

एटीपी मिलीग्राम
Presynaptic पिपेट Postsynaptic पिपेट
NaCl 116 मिमी 3.5 मिमी 3.5 मिमी
KCl 2.5 मिमी
2 CaCl 1.8 मिमी 1 मिमी 1 मिमी
2 MgCl 0.5 मिमी 1 मिमी 1 मिमी
HEPES 10 मिमी 10 मिमी 10 मिमी
ग्लूकोज 5 मिमी
सीएस-ग्लूटामेट * 40 मिमी
सीएस-gluconate ** 50 मिमी 90 मिमी
Tetraethylammonium क्लोराइड 10 मिमी 10 मिमी
9 मिमी 9 मिमी
जीटीपी 0.5 मिमी 0.5 मिमी
EGTA 5 मिमी 5 मिमी
पीएच *** 7.8 7.2 7.2
परासारिता **** 245 mOsm 240 mOsm 240 mOsm

* सीएस-ग्लूटामेट पिपेट समाधान में 40 मिमी CsOH साथ 40 मिमी एल glutamic एसिड को निष्क्रिय द्वारा किया जाता है. ** सीएस-gluconate के एक 1 एम स्टॉक 45-50% डी gluconic एसिड के साथ CsOH का एक समाधान निष्क्रिय द्वारा किया जाता है. *** पीएच विंदुक समाधान के लिए कोशिकी समाधान और CsOH लिए NaOH के साथ समायोजित किया जाना चाहिए. **** बस के नीचे पिपेट समाधान की परासारिता रखते हुए कोशिकी समाधान की है कि सेल सूजन रोकता है और रिकॉर्डिंग की लंबी उम्र को बढ़ाता है.

तालिका1. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता मानक intracellular और बाह्य समाधान के लिए उपकरणों और मानकों.

चित्रा 1
चित्रा 1. रिकॉर्डिंग कक्ष डिजाइन. (एसी) ऊपर, पक्ष, और आयाम दिखा रिकार्डिंग कक्ष के कटअवे देखा गया. चैम्बर एक्रिलिक से एक 2 मिमी मोटी टुकड़ा से machined है. (डी) इकट्ठे चैम्बर. Superfusate Teflon टयूबिंग की एक 10 सेमी लंबाई (; प्रकार 24LW आमद ट्यूब) के माध्यम से चैम्बर में प्रवेश करती है. Superfusate चैम्बर के दूसरे पक्ष पर एक beveled 20 गेज धातु ट्यूब के लिए हल्के सक्शन लगाने से निकाल दिया जाता है. इस उत्पादन में ट्यूब से सटे एक एजी / AgCl गोली संदर्भ इलेक्ट्रोड है. इस संदर्भ इलेक्ट्रोड से नेतृत्व headstage के संदर्भ इनपुट से जुड़ा है. KimWipe के एक छोटे त्रिकोणसमाधान के साथ संपर्क में रखने के लिए और बहिर्वाह ट्यूब में समाधान के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए संदर्भ इलेक्ट्रोड पर रखा गया है. चैम्बर के आधार चैम्बर के recessed किनारों में एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड रखकर बनाई है. स्लाइड वैक्यूम तेल की एक मनका के साथ जगह में आयोजित किया जाता है. रेटिना स्लाइस के साथ nitrocellulose झिल्ली की स्ट्रिप्स प्रवाह के समाधान के लिए एक चैनल है कि फार्म वैक्यूम तेल की माला में एम्बेडेड रहे हैं. पिछले स्लाइस बनाने के लिए, nitrocellulose झिल्ली का एक 5 x 10 मिमी टुकड़ा वैक्यूम तेल के दो छोटे मोतियों के साथ चैम्बर चिपका है. Eyecup का एक टुकड़ा इस nitrocellulose झिल्ली पर vitreal ओर नीचे रखा और रेटिना का पालन करता है एक बार दूर हटा लिया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Ve में डाई से भरे सेल जोड़ेrtical टुकड़ा तैयारी. ए) एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान पैच विंदुक के माध्यम से पेश किया फ्लोरोसेंट रंगों विषम से भर गया है कि एक छड़ी और synaptically मिलकर क्षैतिज सेल की छवियाँ. लूसिफ़ेर पीला (2 मिलीग्राम / एमएल) रॉड विंदुक समाधान (पीला) और sulfarhodamine बी (1 मिलीग्राम / एमएल) क्षैतिज सेल विंदुक समाधान (बैंगनी) में शामिल किया गया था में शामिल किया गया था. फ्लोरोसेंट छवियों को एक ठंडा सीसीडी कैमरा (Orca ईआर) के साथ सुसज्जित है और निश्चित मंच माइक्रोस्कोप (60X, 1.0 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ Nikon E600 एफ एन) के लिए मुहिम शुरू की एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (Perkin एल्मर UltraView LCI) का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. ये चित्र) एक शंकु की छवियाँ और द्विध्रुवी सेल रवाना synaptically मिलकर एडोब फोटोशॉप. बी का उपयोग कर इसी रेटिना स्लाइस के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर मढ़ा गया. द्विध्रुवी सेल अक्षतंतु टर्मिनल के भीतर परमाणु परत के साथ सीमा के पास आंतरिक उलझन - रूप परत की सबसे बाहरी (S1) sublamina में ramifies.

चित्रा 3
चित्रा 3. श्वेत प्रकाश की एक चमकदार 500 मिसे फ्लैश के जवाब में चार अलग रेटिना न्यूरॉन्स से वोल्टेज क्लैंप के तहत दर्ज की धाराओं प्रकाश पैदा. कोन (ए), क्षैतिज सेल (सी) सभी एक जावक वर्तमान के साथ प्रकाश में प्रतिक्रिया व्यक्त की. (डी) पर द्विध्रुवी सेल एक आवक वर्तमान के साथ ही प्रकाश उत्तेजना को जवाब दिया. बंद द्विध्रुवी सेल (सी) द्वारा प्रदर्शित आधारभूत शोर फोटोरिसेप्टर प्रकाश में hyperpolarize जब घटता है कि अंधेरे में synaptic vesicles के एक निरंतर रिलीज को दर्शाता है. इन चार कक्षों से प्रतिक्रियाएँ सफेद रोशनी के तहत तैयार स्लाइस का उपयोग कर अलग रिकॉर्डिंग में प्राप्त किया गया. इन उदाहरणों में प्रयुक्त सफेद प्रकाश उत्तेजना की तीव्रता 1 एक्स 10 5 फोटॉनों / सेक / माइक्रोन 2 की 580 एनएम फोटॉन प्रवाह के बराबर क्षैतिज और द्विध्रुवी कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं का उत्पादन किया.

चित्रा 4
4 चित्रा. ज की वर्तमान वोल्टेज (चतुर्थ) के रिश्तोंorizontal और बंद द्विध्रुवी कोशिकाओं. (ए) शीर्ष पैनल, -120 से एक क्षैतिज सेल को 20 एम वी वेतन वृद्धि (नीचे पैनल) में लागू 40 एम वी 150 मिसे वोल्टेज कदम की एक श्रृंखला के द्वारा पैदा की झिल्ली धाराओं. क्षैतिज कोशिकाओं को आमतौर पर एक कम इनपुट प्रतिरोध और रेखीय या अंदर की ओर सुधार चतुर्थ रिश्ते हैं. वोल्टेज कदम की एक श्रृंखला के जवाब में एक बंद द्विध्रुवी सेल का (बी) चतुर्थ रिश्ता. द्विध्रुवी कोशिकाओं वोल्टेज gated पोटेशियम धाराओं की सक्रियता की वजह से एक उच्च इनपुट प्रतिरोध और एक बाहर सुधार चतुर्थ है.

चित्रा 5
चित्रा 5. बनती रिकॉर्डिंग डेटा के उदाहरण हैं. कोन वोल्टेज gated कैल्शियम वर्तमान की (ए) रिकॉर्डिंग (कोन मैं सीए (कोन वी एम) के एक होल्डिंग क्षमता से -10 एम वी के लिए एक 100 मिसे कदम के जवाब में यूबी>). रिसाव और समाई यात्रियों एक पी / 8 रिसाव घटाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर घटाया गया. एक तेजी से उत्तेजक (EPSC, एचसी पीएससी) वर्तमान बाद synaptic इन दो कक्षों synaptically मिलकर कर रहे हैं दिखा रहा है कि एक क्षैतिज सेल से एक साथ दर्ज की गई थी (बी) एक EPSC किसी अन्य रूप में एक ही उत्तेजना के जवाब में एक बंद द्विध्रुवी सेल में दर्ज की गई थी. कोन.

Discussion

रेटिना टुकड़ा तैयारी circuitry और दृश्य सूचना पर कार्रवाई करने के रेटिना द्वारा नियोजित तंत्र का विश्लेषण करने के लिए बहुत उपयोगी साबित हो गया है. पूर्व और बाद synaptic न्यूरॉन्स से एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की क्षमता के इस प्रयास में विशेष रूप से उपयोगी है. अलग रेटिना परतें उजागर कर रहे हैं क्योंकि बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग फ्लैट माउंट रेटिना तैयारी के साथ तुलना स्लाइस के साथ प्राप्त करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं. इसके अलावा, क्योंकि उनके बड़े रेटिना न्यूरॉन्स की, सैलामैंडर एक रेटिना तैयारी के रूप में एक लंबा इतिहास है और इसलिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से विशेषता मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.

अभ्यास के साथ, समन्दर रेटिना के स्वस्थ स्लाइस नियमित रूप से तैयार किया जा सकता है. कुछ महत्वपूर्ण कदम सफलता और विफलता के बीच अंतर कर सकते हैं. 1) यह सफाई से कांच की सतह और स्लाइस के खिलाफ फ्लैट देता है ताकि धार ऊतक slicer पर मुहिम शुरू की है सुनिश्चित करें कि हालांकि ऊतक और underlyi दोनोंएनजी nitrocellulose झिल्ली. आप nitrocellulose झिल्ली के माध्यम से एक साफ काट दिया है, तो रेजर ब्लेड गिलास स्लाइड की सतह हमलों के रूप में, आप एक बेहोश क्लिक सुनना चाहिए. 2) रेटिना nitrocellulose झिल्ली का पालन किया है सुनिश्चित करें. अन्यथा, रेटिना प्रक्रियाओं के किसी भी कदम के दौरान झिल्ली से तैर कर सकते हैं. 3) इस सतही कोशिकाओं के कई नुकसान होगा, हवा को काट स्लाइस बेनकाब मत करो. 4) रेटिना परतों विदारक खुर्दबीन के नीचे स्पष्ट कर रहे हैं ताकि स्लाइस और nitrocellulose झिल्ली गिलास स्लाइड के खिलाफ फ्लैट झूठ सुनिश्चित करें. 5) रिकॉर्डिंग कक्ष बह निकला से बचने के क्रम में superfusate प्रवाह और बहिर्वाह की दरों को संतुलित करें. इस अचानक ऊतक आंदोलनों का कारण बन सकती है, जो समाधान के स्तर में अचानक परिवर्तन, रोकता है. 6) एक दूसरे के करीब की कोशिकाओं का एक स्वस्थ जोड़ी का चयन करें. चिकनी कोशिका द्रव्य के साथ कोशिकाओं दानेदार कोशिका द्रव्य के साथ कोशिकाओं से स्वस्थ हैं. टुकड़ा में गहरी कोशिकाओं बरकरार अन्तर्ग्रथनी चोर को बनाए रखने की संभावना हैtacts. 7) पिपेट टिप कोशिकाओं के रास्ते पर टूट या अन्य ऊतक या मलबे के खिलाफ धकेल दिया नहीं गया है सुनिश्चित करें. 8) यह मलबा या यह मुश्किल एक गुणवत्ता के पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं, जो दोनों के एक बुलबुला, से भरा हुआ नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट प्रतिरोध की जाँच करें.

बल्कि nitrocellulose, फिल्टर पेपर के लिए रेटिना संलग्न की तुलना में, कुछ जांचकर्ताओं अगर एक ब्लॉक में retinas एम्बेड और रेटिना स्लाइस में कटौती के लिए एक vibratome का उपयोग करें. हम इस दृष्टिकोण की कोशिश नहीं की है, किम एट अल. 11 दोनों दृष्टिकोण के लाभों पर चर्चा. अपने अनुभव में, अगर आधारित दृष्टिकोण अच्छी तरह चित्रित रेटिना परतों के साथ फ्लैट स्लाइस की एक और अधिक सुसंगत उपज प्रदान करता है, लेकिन फिल्टर पेपर आधारित दृष्टिकोण स्वस्थ फोटोरिसेप्टर पैदावार.

छड़ और शंकु झिल्ली क्षमता में परिवर्तन में प्रकाश transducing के लिए जिम्मेदार हैं. बनती रिकॉर्डिंग के साथ, छड़ या शंकु की झिल्ली संभावित manipul हो सकता हैप्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोगी है, जबकि आवश्यक नहीं हो सकता है, सीधे और इतने हल्के प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने की क्षमता पैदा. इसलिए हम अक्सर सफेद रोशनी में स्लाइस तैयार करते हैं. छवि में प्रतिक्रियाओं से यह साफ है फिर भी, जैसा चमकदार रोशनी के तहत तैयार की गई है, जब भी समन्दर रेटिना न्यूरॉन्स बड़े प्रकाश प्रतिक्रियाओं उत्पन्न कर सकते हैं. 3. इस बड़े बाहरी खंड मात्रा में क्रोमोफोर की एक अपेक्षाकृत बड़े जलाशय की वजह से है, लेकिन यह भी शंकु 12 के लिए 11-सीआईएस रेटिना को पुनर्जीवित करने मुलर कोशिकाओं की क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. पूरी तरह से काले अनुकूलित प्रकाश प्रतिक्रियाओं प्राप्त करने के लिए, एक अवरक्त रोशनी के तहत स्लाइस तैयार कर सकते हैं. अवरक्त प्रकाश के तहत dissections के लिए, हम विदारक माइक्रोस्कोप के oculars के लिए GenIII छवि intensifiers (Nitemate NAV3, Litton इंडस्ट्रीज, Tempe, AZ) देते हैं और एक अवरक्त एलईडी टॉर्च के साथ ऊतक रोशन. टुकड़ा करने की क्रिया और विदारक माइक्रोस्कोप के तहत आयोजित नहीं कर रहे हैं कि अन्य प्रक्रियाओं के लिए, हम एक सिर पर चढ़कर भारतीय सैन्य अकादमी को रोजगारजीई intensifier. पैच pipettes के प्लेसमेंट के लिए हम ईमानदार, निश्चित अवस्था खुर्दबीन के लिए मुहिम शुरू की एक अवरक्त के प्रति संवेदनशील सीसीडी कैमरा (जैसे Watec 502H, Watec इंक, मिडलटाउन, हिन्दी अनुवाद) का उपयोग स्लाइस कल्पना. इन सावधानियों के साथ, एक फोटान संवेदनशीलता 6, 13 प्रदर्शन रॉड प्रतिक्रियाएं प्राप्त कर सकते हैं.

रेटिना स्लाइस में काम करने की एक सीमा है कि बड़े क्षेत्र रेटिना न्यूरॉन्स की लंबी सेलुलर प्रक्रियाओं टुकड़ा करने की प्रक्रिया के दौरान उनके dendrites के कई खो सकता है. रेटिना टुकड़ा तैयारी इसलिए synaptic संपर्कों सेल शरीर के करीब प्रक्रियाओं शामिल है जिसमें कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए अधिक उपयोगी होते हैं. उभयचर और स्तनधारी retinas के एक ही प्रकार की कोशिकाओं के कई हिस्सा है और इसी तरह के शारीरिक तंत्र 14-16 उपयोग. समन्दर रेटिना स्तनधारी रेटिना के कई पहलुओं के लिए एक अच्छा मॉडल है, एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि स्तनधारियों में एक समर्पित रॉड मार्ग की उपस्थिति प्रतीत होता है कि invoअजमेर amacrine कोशिकाओं 14 पर विशेष छड़ी द्विध्रुवी कोशिकाओं के lves संपर्क. समन्दर रेटिना की एक और सीमा इस प्रजाति के लिए विशेष रूप से विकसित आनुवंशिक उपकरण की छोटी संख्या है. हालांकि, अन्य प्रजातियों में लक्ष्य अच्छी तरह से संरक्षित क्षेत्रों के समन्दर में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है कि एंटीबॉडी और shRNA अभिकर्मकों, के रूप में कर सकते हैं कई छोटे अणु inhibitors और पेप्टाइड अभिकर्मकों. इसके अतिरिक्त, तकनीक में कुछ संशोधनों के साथ रेटिना स्लाइस इन उपकरणों में से कुछ अधिक आसानी से उपलब्ध हैं, जिसमें अन्य प्रजातियों से तैयार किया जा सकता है.

बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इसकी उपयोगिता से परे, समन्दर रेटिना टुकड़ा तैयारी भी अन्य दृष्टिकोण की एक किस्म के लिए उत्तरदायी है. ऊपर चर्चा की, रेटिना स्लाइस विभिन्न वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल 17 के साथ संयोजन में प्रकाश प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रेटिना न्यूरॉन्स भी 2 सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लोड किया जा सकता है +, सी.एल. -, या ना+ पैच विंदुक के माध्यम से या स्नान आवेदन 15,18-20 द्वारा शुरू की. अन्तर्ग्रथनी रिबन 21 को बांधता है कि एक फ्लोरोसेंट पेप्टाइड पैच विंदुक के माध्यम से पेश किया है और जब fluorescein संयुग्मित, तीव्रता और चुनिंदा रिबन 22 को नुकसान पहुँचाए के लिए इमेजिंग रिबन 10 या, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी छड़ी पर व्यक्तिगत कैल्शियम चैनल और कोन synaptic टर्मिनलों 23 की गतिविधियों पर नजर रखने के लिए क्वांटम डॉट्स के साथ संयोजन में रेटिना स्लाइस का इस्तेमाल किया है. इस प्रकार, ऊर्ध्वाधर रेटिना टुकड़ा बुनियादी अन्तर्ग्रथनी तंत्र और दृश्य संकेत मार्ग में पहली synapse में प्रदर्शन अद्वितीय प्रसंस्करण कार्यों के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी प्रयोगात्मक तैयारी है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम दृष्टिहीनता और स्वास्थ्य अनुदान EY10542 के राष्ट्रीय संस्थानों को रोकने के लिए अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue slicer Stoelting 51425
Double edge razor blades Ted Pella, Inc 121-6
Nitrocellulose membranes Millipore AAWP02500 Type AAWP 0.8 mm pore
Borosilicate glass pipettes World Precision Instruments TW120F-4 1.2mm OD 0.95 mm ID
Ag/AgCl pellet Warner E206
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 34 ga. Filling needle, 67 mm long

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References

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Comments

2 Comments

  1. hii
    can you help me in zymography?
    i want to detect serin protease in plasma of hemodyalsis patients, but i cant get a good result
    can you please tell me how i deluited the plasma??
    thank you and i`m waiting for your answer
    eman khatib
    isreal

    Reply
    Posted by: eman k.
    June 1, 2013 - 2:22 PM
  2. Hi,
    Why is the pH value of amphibian saline adjusted to 7.8 rather than 7.4?
    Thanks!

    Reply
    Posted by: Tina L.
    November 22, 2013 - 3:25 AM

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