Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Существует растущий интерес в понимании иммунологических функций конкретной субпопуляции клеток в Пейеровы бляшки (PPS), первичные индуктивных участков кишечника связанных лимфоидной ткани. Здесь мы наметим параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии анализа и PP cryosections для иммунной окраски.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Пейеровы бляшки (ПП) являются неотъемлемой частью кишечника, лимфоидной ткани (GALT) и играют центральную роль в кишечном иммунологического и гомеостаза. Частицы антигенов и микроорганизмов в просвете кишечника постоянно, отобранных PP клетки M в фолликул связанных эпителия (FAE) и транспортируется в основной сети дендритные клетки (ДК), макрофаги и лимфоциты. В этой статье мы опишем протоколы, в которых мышиные ПП являются: (I) распадается на одном суспензии клеток и подвергали проточной цитометрии и (II), подготовленный для cryosectioning и иммунной. Для проточной цитометрии, PPS механически диссоциированных и затем фильтруют через 70 мкм мембран для создания одного клеточные суспензии бесплатно эпителиальных клеток и крупного мусора. Начиная с 20-25 PPS (от четырех мышей), этот быстрый и воспроизводимый метод дает населению> 2,5 х 10 6 клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Для cryosectioning, свежиеют изолированным PPs погружены в оптимальной температуры резания (ОКТ) среды, оснастки замороженной в жидком азоте, а затем разрезе использования cryomicrotome. Срезы тканей (5-12 мкм), сушат на воздухе, фиксировали ацетоном или метанолом, а затем подвергают иммунного.

Introduction

Пейеровы бляшки (ПП) являются макроскопические агрегаты организованных лимфоидных фолликулов присутствует во всем тонком кишечнике людей и мышей (рис. 1) и составляют основные сайты, на которых слизистых иммунных ответов, возбужденное в отношении диетических антигенов, синантропных бактерий, патогенных микроорганизмов, а также пероральных вакцин 1-4. В отличие от других периферических лимфоидных тканей, таких как мезентериальных лимфатических узлов, PPS не хватает афферентные лимфатические сосуды. Таким образом, адаптивный иммунный ответ в PPs приводятся в ответ на антигены, полученные из просвета кишечника. Выборка просвета антигенов осуществляется по фолликула связанных эпителия (FAE), который состоит как из энтероцитов и антиген-отбор проб клеток, известных как М-клетки. Под FAE, в суб-эпителиальные купола (SED) области, лежит сети дендритные клетки (ДК) смешались с макрофагами, В-клетки и CD4 + Т-клетки 5-9. В основе каждой PP лимфоидной folliclе, фолликулярные дендритные клетки (ФСКН) и В-клеток, богатых центрального зародышевого центра, в окружении Т-клеток богатых зон интерфолликулярной. Антиген отбора образцов, ПП результатов в развитии IgA + В-клеток plasmablasts и CD4 +-эффекторов и клеток памяти, что семена окружающих ргорпа пластинки и обеспечивает иммунитет к широкому спектру к слизистой оболочке захватчиков.

Пройдя сложные события, связанные с иммунологической антиген выборки, обработки и представления в PPs является непростой задачей, учитывая, что PP клетки составляют лишь малую долю от общего лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишечника. Чтобы помочь в в пробирке характеристика клеток в этой среде, мы предоставляем протокол для подготовки общего мыши PP ячеек для проточной цитометрии и функционального анализа, а также протокол для подготовки PP cryosections для иммунофлуоресцентного микроскопии и immunohistology. Наш протокол для выделения, характеристика и иммуноокрашивания МоВэлектронной PP клеток не нова сама по себе, о чем свидетельствует тот факт, что имеются многочисленные ссылки насчитывает более 25 лет, что привести эти методы 5,6,9-11. Скорее всего, наш протокол обеспечивает обтекаемый (и визуальный) метод для следователей сбора PPs в первый раз. Методы мы опишем легко освоили и легко получить большое количество клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Cryosectioning протокол дает высокую воспроизводимость серийных срезов идеально подходит для окрашивания иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Кроме того, наш протокол дополняет два других недавних статей Юпитера. Во-первых, Фукуда и коллег, описывает использование лигированную подвздошной анализы цикла для оценки поглощения патогенных бактерий PP клетки M 12. Другой, Geem и коллег, описывает выделение и характеристика ДК и макрофагов мыши слизистой оболочки кишечника, но явно исключает ПП от их анализ 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животные были размещены в обычных, специфических патогенов без условий и лечились в полном соответствии с институциональной животных Wadsworth центра по уходу и использованию комитета (IACUC) руководящих принципов.

1. Желудочный зонд

  1. (Необязательно) зонд мыши штамма выбор с антигеном или микробов интерес помощью 22 G x1.5-в. тупой конец иглы кормления (Popper научных, New Hyde Park, NY). Объемы поставок не должна превышать 400 мкл на мышь.

2. Изоляция PP Клетки для проточной цитометрии

  1. Усыпить мышей CO 2 удушья, в соответствии с институциональными и использования животных комитета (IACUC) руководящих принципов.
  2. Очисти живота с 70% этанола или бетадин до операции. Выполните стандартную лапаротомию, которая включает одну (1 см) разреза с использованием хирургических ножниц класса по средней линии начала около 1,5 см от основания грудной клетки. Expose вitoneal полости и определить слепой кишки. Надрез терминал тонкой кишки в подвздошную-слепой кишки соединения и осторожно удалить кишечник в полном объеме. Будьте осторожны, не hyperextend кишечной ткани, как это будет удален из брюшной полости.
  3. Положите тонкую кишку на кровати влажные бумажные полотенца или Kimwipes. Смочить тонкий кишечник мягко физиологическим раствором, чтобы предотвратить обезвоживание тканей. Визуально определить индивидуальный PPs расположен на анти-брыжеечной стороне кишки (рис. 1). Как правило, один мышь имеет от 5 до 10 видимых PPs, которые равномерно распределены из двенадцатиперстной кишки (проксимального) в подвздошной кишки (дистальный). В среднем, четыре мышей даст 23 ПЗ.
  4. Используя изогнутые хирургические ножницы, аккуратно акцизного отдельные ПЗ и поместить их в сбалансированный солевой раствор холодным Хэнка (HBSS). Обратите внимание, ножницы должны быть размещены кривой вверх чуть выше PP, а затем аккуратно наносят на ткань. Акцизный только PP (не surroundiнг ткани) и трансфер в холодном HBSS.
    Примечание: Все инкубации и центрифугирования шаги с этого момента в разделе 2 должно быть сделано при 4 ° С, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
  5. Передача PPs в 5 мл селезенки Диссоциация средних и инкубировать в течение 15-20 мин при 37 ° С при интенсивном встряхивании при 250 оборотах в минуту. Больше времени инкубации отрицательно скажется на жизнеспособности клеток.
  6. Для создания суспензии отдельных клеток, место PPs на стерильную (автоклавного) 70 мкм нейлоновый фильтр ячейки сетки и насильно молоть ткани в сетку, используя базу поршень от 1 мл шприца. Кроме того, сэндвич-ПП между двумя матовыми стерильные стеклянные предметные стекла (автоклаве в конвертах) и осторожно растереть тканей с возвратно-поступательное движение. С помощью стерильной пипетки передачи для передачи клеточной суспензии в 5 мл трубки Falcon.
  7. Добавить ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ к клеточной суспензии. Выдержите на качалку для5 мин при комнатной температуре.
  8. Слейте клеточной суспензии через второе сито 70 мкм ячейки для удаления остатков сотовых агрегатов или ткани мусора. Сбор клеток в 15 или 50 мл коническую трубку.
  9. Тема клеток нежной центрифугированием (5 мин при 500 мкг). Слейте супернатант и ресуспендирования клеток в потоке буфер, который является фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).
  10. Для определения количества клеток и жизнеспособности, разбавления клеток в 1:10 трипанового синего и осмотрите клетки с помощью светового микроскопа и гемоцитометра. Кроме того, счетчик графиня клетки (Invitrogen) или аналогичный прибор может быть использован для автоматического перечисления числа клеток и жизнеспособность.
    Начиная с 20-25 ПП, этот протокол должен дать> 2,5 х 10 6 общего числа клеток. Это соответствует ~ 0.8-1.2 х 10 6 клеток на мышь.

Антитела маркировки Клетки для проточной цитометрии

<ПР начала = "11">
  • Внесите клеток (10 5 на лунку) в лунки 96-луночных круглым дном тарелку.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливать супернатант осторожно обращения пластины.
  • Ресуспендируют клеток в буфере блока Fc и инкубировать на льду в течение 15 мин. Хотя есть ряд коммерчески доступных буферов Fc блока (например, антимышиным CD16/CD32, BD Biosciences), мы просто используем провели среды от крыс В-клеток гибридомы (ATCC 2.4.G2), которая выделяет моноклональных IgG 1 против мышиных Fcγ рецепторами для этого шага.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), как указано выше, и переливать супернатант осторожно обращения пластины.
  • Добавить флуорофор-конъюгированных антител непосредственно к суспензии клеток в нужном разведении, и инкубировать на льду в течение 30 мин с непрерывным качалке.
  • Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливатьсупернатант осторожно обращения пластины.
  • Вымойте клеток с 100 мкл буфера потока.
  • Центрифуга пластины при 1000 х г в течение 5 мин и супернатант сливают, осторожно обращения пластины.
  • Ресуспендируют клеток 400 мкл буфера фиксации, которая состоит из 300 мкл буфера потока и 100 мкл 1% параформальдегидом в PHEM буфера (60 мм труб, 25 HEPES мм, 10 мм EGTA, 4 мМ MgCl 2 при рН 6).
  • Тема клеток проточной цитометрии с использованием FACSCalibur или эквивалент. Анализ результатов с помощью Cell Quest Pro версии 5.2.
  • 3. Подготовка PP Cryosections

    1. В преддверии ткани коллекции, добавить Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения 7x7x5 мм пластиковых форм базы. Также подготовить бассейн жидкого азота (> 750 мл) в ведре Дьюара или льда.
    2. Усыпить мыши и выполните laparotamy, как описано выше. Удалить кишечника и место на мокрые бумажные полотенца.
    3. Кизолировать PPs для cyrosectioning, нарезать 0,5 см поперечного сегмента тонкой кишки, содержащие один PP и передачу ткани на чашку Петри, содержащую PBS. Аккуратно промойте полость из этих сегментов с PBS для удаления нежелательных фекальных мусора.
    4. Поместите кишечные сегменты ткани вертикально внутри базы форм содержащие октября Погрузитесь форм в жидкий азот и позволяет ткани, чтобы заморозить полностью (1-2 мин). Цвет октября будет меняться от прозрачного до белого, когда ткань полностью заморожены. . Для более постепенным охлаждением (например, для уменьшения растрескивания OCT), погрузить плесень в ванной изопентана охлаждается жидким азотом паров Примечание: Носить соответствующие защитные очки при работе с жидким азотом.
    5. Удалить замороженных форм базы с жидким азотом с помощью пинцета и позволит формы согреться при комнатной температуре достаточно долго (~ 10-15 сек), чтобы краям блока октября, чтобы смягчить. Чтобы затем удалить замороженные блоком октября отпресс-формы, переверните форму и аккуратно нажмите на спине, чтобы извлечь блок на чистое 4 х 4 см кусок алюминиевой фольги. Сразу обернуть тканью в фольгу и положить в сумку помечены образцы хранятся в жидком азоте или с сухим льдом. Кроме того, передача тканей в морозильной камере (<-20 ° C). Использование ткани в течение недели, в противном случае блоки становятся ломкими с возрастом.

    Cryosectioning

    1. Cryosection ткани с помощью Leica CM3050S cryomicrotome или эквивалент. Температура в камере на криостата должны быть установлены до -21 ° C.
    2. Стремитесь к разделам, которые являются 12-14 мкм в толщину.
    3. Сбор разделов на Fisher SuperFrost Plus (или эквивалент) предметные стекла микроскопа и визуального осмотра с использованием стандартной низкой световой микроскоп власти. Если несколько разделов, которые собираются на слайде, чтобы они сгруппированы вместе для последующих применений окрашивания.
    4. Магазин тОн скользит при комнатной температуре в режиме слайд-бокс и, в идеале, использовать их в течение нескольких дней.

    Антитела маркировки Cryosections и конфокальной микроскопии анализа

    1. Погрузитесь слайды в ацетоне (или метанол) в тканях банку окрашивания или стеллажи на 2 мин. Длительная инкубация может привести к тканям оторваться от слайда.
    2. Передача слайдов в новом банке окрашивания и промыть 3 раза PBS-T (1X PBS с 0,05% Tween-20) в течение 3 минут каждый.
    3. Окружите участки с гидрофобным перо ImmEdge. Это гарантирует, что реагенты и антитела останутся ограничивается этой области во время инкубации.
    4. Инкубируйте слайды в блоке буфера (2% козьей сыворотки в PBS) в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере, защищенном от света месте.
    5. Инкубируйте слайды с Fc блок буфера (см. выше) в течение 10 мин при 37 ° C.
    6. Dip слайдов в PBS-T и сухой области вокруг разделы, используя Kimwipes или другие абсорбирующие ткани.Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов.
    7. Наложение срезов ткани с первичным решением антител и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере. Первичные антитела, как правило, разводят в блоке буфера до конечной концентрации 20 мкг / мл. Использование непосредственно-меченые антитела первичного желательно, потому что целых три антитела могут быть объединены непосредственно на этот шаг. Непосредственно-меченых антител также устраняет необходимость в дополнительных шагов инкубации антитела.
    8. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
    9. Если необходимо, инкубировать слайды с соответствующими вторичными антителами в течение 30 мин при 37 ° C в камере влаги.
    10. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
    11. Инкубируйте слайды в течение 4 минут в 1% параформальдегидом в буфер PHEM, как описано выше.
    12. Промыть слайдов с PBS в течение 1 мин.
    13. Сухая зона вокруг разделы, используя Kimwipes или другие поглощаютных тканей. Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов. С помощью пипетки или капельницы, аккуратно поместите каплю продлить Золотой монтажа средних непосредственно на раздел. Применить стекло покровное на монтажной средой заботясь, чтобы избежать пузырей. Используйте промокательной бумаги, чтобы поглотить излишки монтажной среды.
    14. Печать покровные для микроскопа слайды с коммерческими лак для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
    15. Просмотр слайдов с Leica TCS SP5 или эквивалентной конфокальной микроскопии.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Проточной цитометрии анализа монодисперсных суспензий от общего числа клеток PP показывает четкое различие между хорошей и плохой подготовкой клетки. В хорошем клеточные препараты с более чем 80% жизнеспособность, подавляющее большинство клеток демонстрируют высокую рассеяния вперед (FSC), показатель высокого объема клетки, и низкий разброс стороны (SSC), индикатор низкой детализации ячейки (рис. 2A). В этом эксперименте мы также намеренно подготовили "плохой подготовке ячейки" путем инкубации клеток при ПП изоляции шагов при комнатной температуре (а не на льду), а в последнем шаге, инкубации клеток с PBS плюс 1% FCS (вместо PHEM буфера). В этих бедных клеточные препараты, большинство из клетки обладают низкой и высокой FSC SSC и находятся за пределами указанных ворота R1 (рис. 2В). Эти клетки, вероятно, апоптоза и / или некроза.

    На рисунке 3 показано использование коктейля до четырех ди-fferent флуорофора конъюгированных моноклональных антител к дискриминации между различными типами клеток в суспензии PP одну ячейку. Маркировка с кластером дифференцировки (CD) маркерам CD19 и B220 показывают, что В-клетки составляют ~ 60% закрытого клеточной популяции PP (рис. 3А). Конкретные T подмножеств клеток могут быть легко перечислить двойной маркировки с антителами против CD3 и CD4 (рис. 3В) или CD3 и CD8 (рис. 3). CD4 + и CD8 + Т-клетки составляют ~ 23% и ~ 9% соответственно от общей клетки PP. ДК подмножества помечены CD11c + (рис. 3D) и CD103 + (не показано) может также быть перечислены с помощью этого метода. CD11c + ДК способствуют около 8% от общего закрытого населения, что примерно эквивалентно до 10000 РС в PP. Это в точности совпадает с числом РС наблюдаются другие 14.

    Среди населения CD11c + +. Аналогичные результаты получены при PP клетки собраны из C57B / 6 мышей (Рис. 3E).

    "Плохо" клеточные препараты могут привести к весьма ошибочные результаты, во многом потому, что мертвые или умирающие клетки, как правило, связываются антителами, не специально. Как показано на рисунке 4, популяция клеток, что пятно положительной как для маркера клеток (B220) и T маркеров клеток (CD3, панели; CD4, группа В) может отличаться более чем 3-кратное между хорошим и плохая подготовка ячейки. рисунке 4 показана по представлению B220 + и CD3 + двойной-позитивных клеток (панели), а также B220 + В-клеток и CD4 + Т-клетки дважды положительных клеток (группа B) в бедной клеточные препараты. Как отмечалось выше, различие в относительных B и T количества клеток в хорошем сравнению с бедными, вероятно, из-за неспецифического связывания антител умирающих клеток.

    Наш протокол также показывает, что мыши PP cryosections поддаются гистопатологического анализа, а также иммунного. Рисунок 5 сравнивает H & E окрашивание мыши PPs парафин (панели A, B) и замороженных срезах (панель C). В то время как парафиновые срезы обеспечивают более высокое разрешение на клеточном уровне, когда окрашиваются H & E, светлых и темных зон PP зародышевых центров легче разграничены в cryosection разделов (рис. 5A-C). H & E-окрашенных cryosections полезны для бок-о-бок сравнения с immunolabeled cryosections. Типичный cryosection PP окрашивали анти-CD3 антитела для обозначения Т-клеток, анти-CD11c антитела, чтобы выделить ДК и анти-B220 антитела к В-клеток выделить показано на рисунке 6.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Мышь Пейера ПАТСГЭС. Изображение недавно вырезали тонкий кишечник мыши с тремя видимыми PPS (белые стрелки). PPs появляются как блистер-подобные структуры (5 х 5 мм) на анти-брыжеечной стороне кишечных серозной.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Всего PP клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Подвески монодисперсных от общего числа клеток PP подвергали проточной цитометрии с использованием BD FACSCallibur. (A) Пример хорошей подготовкой клетки. Подавляющее большинство клеток демонстрируют высокую рассеяния вперед (FSC), показатель высокого объема клетки, и низкий разброс стороны (SSC), индикатор низкой детализации ячейки. Эти клетки являются боксировал в R1. Клетки с низким и высоким FSC SSC, расположенных за пределами R1 ворот, которые считаются мертвых или умирающих клеток. (B) Пример плохой подготовки клетка, в которой большинство клеток находятся за пределами воротR1 из-за низкой FSC и высокой SSC.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Представитель проточной цитометрии анализа PP лимфоцитов. Монодисперсных суспензий от общего числа клеток PP инкубировали с флуорофором-сопряженных первичных антител и затем подвергали проточной цитометрии. (A) CD19 и B220 маркировка PP-клеток. (BC) Дважды маркировки общей популяции клеток с CD3 и CD4 (B) или CD8 (C) для перечисления специфических Т подмножеств клеток. (D) Двойная маркировка от общего числа популяции клеток для B220 (B маркером клетки) и CD11c (округ Колумбия). (E) Сравнение B220, CD3 , CD4, и CD11c пятна на PP клетки от BALB / с и C57B / 6 мышей.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Ложная проточной цитометрии данным, в результате плохой клеточных препаратов PP. Хорошие (левая панель) и бедные (правая панель) PP клеточные препараты окрашивали (A) антител к CD3 B220 и дифференцировать B и Т-клеточной популяции или (B) антитела для B220 и CD4 дифференцировать В-клеток из подгруппы Т-клеток. Есть вообще очень мало клеток из клеток, которые пятном положительным для B220 и CD3 CD4 или, как показано в левой панели. В противоположность этому, в бедных клеточные препараты двойного-позитивные клетки составляют почти 20% от общего объема клеток. См. текст для более подробной информации относительно того, что представляет собой "бедных" клеточный препарат.

    Рисунок 5
    Рисунок 5. Представитель H & E-окрашенных PP разделов. Парафиновые срезы (A, B) или cryosections (C) из подвздошной PPс окрашивали H & E и визуализировали с помощью световой микроскопии. Обратите внимание, что светлые и темные зоны лимфоидных фолликулов легко разграничены в cryosections, по сравнению с парафином разделов. Сокращения: V, ворсинок; FAE, фолликулостимулирующего связанных эпителия; SED, к югу от эпителиальных куполом, LF, лимфоидных фолликулов.

    Рисунок 6
    Рисунок 6. Иммунофлуоресцентного маркировки мышиный cryosections PP. Свежесрезанных срезах тканей одной мыши PP были, сушат на воздухе ацетона фиксированных и окрашенных (A) FITC-сопряженных анти-CD3 антитела для обозначения Т-клеток в меж-фолликулярная регионов и собственной пластинки; (B) PE-сопряженных анти-CD11c антитела для выделения домена в СЕПГ, и (C) APC-сопряженных анти-B220 антитела, чтобы выделить В-клетки (D) композитного вывода.F изображения в панели AC создан с помощью программного обеспечения Фиджи. Шкала бар ~ 100 мкм.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    В этой статье мы предоставили параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и cryosections для иммунной окраски. Оба метода являются высокая воспроизводимость и легко доступны, при условии, цитометра и криостат имеются. Для первых исследователей время следует отметить, что по сравнению с селезенкой, общий выход ячейки из ПП сравнительно скудными. Тем не менее, протокол мы приводим обычно дает от 0.8-1.2 х 10 6 общее PP клеток из одной мыши. Масштаб деятельности является возможным, хотя мы обычно не бассейн более 20-25 ПП, потому что, по нашему опыту, агрегация происходит, и клетка дает (и жизнеспособность) снижение значительно. С другой стороны, мы не рекомендуем использовать менее 15 PPs для этого протокола, как критическая масса необходимых для успешного выполнения клетки через всю процедуру изоляции. Если максимальная жизнеспособность клеток является одним из приоритетных для последующего функциональногоАнализы, мы рекомендуем маленький образец изолированные клетки подвергаются окрашиванию йодистым пропидия для обеспечения более точного стробирования жизнеспособной пула клеток из общей популяции клеток PP. Наконец, следует отметить, что наш метод поддается сортировки клеток приложений, если определенное подмножество клетки желаемой для приемных передачи или в пробирке анализа, например.

    Коллекция PPs для cryosectioning относительно проста, хотя фактически срезов тканей PP может быть сложной задачей. Очень важно, что, например, PP ткани правильно ориентироваться в формах (т. е. перпендикулярно к основанию формы), чтобы гарантировать, что истинная поперечных сечениях получаются. Мы предлагаем оснастку замораживания PP ткани, а затем подвергая cryosections для осаждения фиксаторов, как ацетон или метанол сохранить антител реактивности ("антигенности"), хотя осаждения фиксаторов приводит к снижению общего клеточном и субклеточном резольногоution. Если сохранении антигенности не вызывает особую озабоченность, то мы рекомендуем использовать сшивающие фиксаторов, как параформальдегид (PFA), что приводит к лучшему сохранению клеточных и субклеточных структур. Действительно, PFA могут быть использованы, чтобы исправить тканей до cryosectioning. Просто погрузите недавно вырезали PPS В обильным количеством 4% PFA в течение> 2 часов, промыть ткань с PBS для удаления избытка фиксатора, равновесие тканей сахарозы (15%), при желании, а затем вставлять в октябре, как описано выше. Ткань может быть cryosectioned, но должны быть заблокированы с глицином раствора (0,1 М в PBS в течение 15 минут), чтобы утолить остаточного реактивного PFA до иммунной окраски.

    Наконец, в то время как мы описали протоколы для иммунофлуоресцентного маркировки PP cryosections, эти же разделы поддаются иммуногистохимии (IHC) с использованием коммерчески доступных наборов IHC (например, Vector Labs, Burlingame, CA). Для IHC, необходимо включить пероксидазы блокирование или QuEncасафетиды шаг в протоколе, как эндогенные пероксидаз широко распространены в слизистой оболочке кишечника. Другие отметили, что для IHC, сердечной перфузии мышей с 4% параформальдегидом в PBS улучшает консервации тканей.

    В итоге, мы предоставили параллельных и дополнительных протоколов для количественного и функционального анализа мышиных клетках PP, в том числе лимфоцитов и РС. Подготовка одного клеточные суспензии позволяет количественных и функциональных в пробирке анализ основных типов клеток в ПЗ, в то время иммунного из cryosections предоставляет информацию о локализации специфические типы клеток, а также межклеточные взаимодействия, которые существуют на местах. Основным ограничением обоих этих подходов является то, что ни представляет «реального времени» Визуализация PP межклеточных взаимодействий. На данный момент по крайней мере, PP, оказались невосприимчивыми к прижизненной визуализации, техника, которая произвела революцию понимания лимфоцитов динамическиCS в периферических лимфатических узлов. До технические барьеры, ограничивающие прижизненных изображений PPs будут преодолены, протоколы, описанные в этой статье для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и ПП cryosections для иммуноокрашивания будет оставаться основным средством изучения и понимания иммунологических функций определенных групп -популяций клеток в ПЗ, основной индуктивных участков кишки лимфоидной ткани.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Нет конфликта интересов объявлены.

    Acknowledgements

    Мы благодарим Renjie Song (Wadsworth центр проточной цитометрии Core) за помощь в анализе клеток и Хелен Джонсон (Wadsworth Центра животных Гистопатология Core) для приготовления парафиновых срезов. Мы благодарим д-р Ричард Э. Коул (Wadsworth Центра световой микроскопии Core) за помощь в конфокальной микроскопии и коллекции изображений. Мы хотели бы поблагодарить Энди Bentley (Wadsworth центр Фото и иллюстрации) за помощь с анимацией.

    MDJ при поддержке Фонда исследований науки о жизни, Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) Fellowship. SA при поддержке Центра Wadsworth-Health Research Инк очной докторской стипендии. Эта работа была частично поддержана грантами NIH HD061916 и GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics