Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC'ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir> 2,5 nüfusu verir x 10> 90% hücre canlılığı ile 6 hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Introduction

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil 1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 + T hücreleri 5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 + efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar.

PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler 5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca>% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri 12 ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC'ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz 13 PPs dışlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi.

1. Oral Gavaj

  1. 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir.

2. Akış sitometrisi için PP Hücre İzolasyonu

  1. Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) kurallarına göre, CO 2 boğulma tarafından fareler Euthanize.
  2. % 70 etanol veya cerrahi öncesi betadin ile karın temizleyin. Göğüs kafesinin tabanı 1,5 cm'lik orta hat başında birlikte cerrahi sınıf makas kullanarak tek bir (1 cm) kesi yapılır standart laparotomi gerçekleştirin. Başına Açığapreperitoneal kavite ve körbağırsak tanımlar. Ileal-çekal kavşakta terminali küçük bağırsak Kırpmalı ve yavaşça bütünüyle bağırsak çıkarın. Bu periton boşluğuna kaldırılır ediliyor gibi bağırsak dokusundan hyperextend vermemeye özen.
  3. Nemli kağıt havlu veya Kimwipes bir yatak üzerinde ince bağırsak yatırın. Doku kaybını önlemek için tuzlu su ile hafifçe ince bağırsak ıslatın. Görsel olarak bağırsak (Şekil 1) 'in anti-mesenterik tarafında bulunan bireysel PPs tanımlar. Genellikle, tek bir fare eşit ileum (distal) için duodenum (proksimal) dan dağıtılır 5 ila 10 görünür PPs vardır. Ortalama olarak, dört fare 23 PPs verecektir.
  4. Kavisli cerrahi makas, yavaşça tüketim bireysel PPs ve soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) koyun kullanma. Not, makas sadece PP yukarıda eğri tarafı yukarı yerleştirilir ve daha sonra yavaşça dokuya uygulanmalıdır. Tüketim sadece PP (değil surrounding doku) ve soğuk HBSS transfer.
    Not: İleri Bölüm 2'de bu noktadan tüm inkübasyonlar ve santrifüj adımları ° C hücre canlılığı korumak için 4 yapılmalıdır.
  5. 37 az 15-20 dakika için 5 ml Dalak Ayrılma Orta ve inkübe içine PPs aktarın ° C kuvvetlice 250 rpm'de sallayarak ise. Daha uzun inkübasyon süresi olumsuz hücre canlılığı etkileyecektir.
  6. Steril (otoklav) 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu, yer PPs oluşturmak ve zorla bir 1 cc şırınga bir pistonun tabanı kullanılarak örgü içine doku öğütmek için. Alternatif olarak, iki buzlu steril cam mikroskop slaytlar (zarf içinde otoklava) ve hafifçe ileri geri hareket ile dokulara öğütmek arasında sandviç PPs. Bir 5 ml Falcon tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak için bir aktarma steril pipet kullanın.
  7. Hücre süspansiyonu ile 1 mm arasında bir nihai konsantrasyon için EDTA ekleyin. Bir rocker üzerinde inkübeOda sıcaklığında 5 dakika.
  8. İkinci bir 70 mikron hücre süzgecinden Durusu hücre süspansiyonu kalan hücresel toplamları veya doku enkaz kaldırmak için. 15 ya da 50 ml konik tüp hücreleri toplayın.
  9. Nazik santrifüj Konu hücreleri (500 x g'de 5 dakika). Fosfat salin (PBS)% 1 dana fetus serumu (FCS) içeren tamponlu bir akış tampon içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant Durusu hücreler.
  10. Hücre sayısı ve canlılığı belirlemek için, tripan mavisi içinde 1:10 hücrelerin sulandırmak ve görsel bir ışık mikroskobu ve bir hemasitometre kullanarak hücrelerin kontrol edin. Alternatif olarak, bir Kontes hücre sayacı (Invitrogen) veya benzer bir cihaz otomatik hücre numaralarını ve canlılığı numaralandırmak için de kullanılabilir.
    20-25 PPs ile başlayarak, bu protokol> 2.5 x 10 6 total hücre boyun eğmek zorundadır. Bu ~ 0.8-1.2 fare başına x 10 6 hücre eşittir.

Akış sitometrisi için Hücrelerinin Antikor Etiketleme

<ol start = "11">
  • Bir 96-kuyu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyularına hücreleri (çukur başına 10 5) dağıtın.
  • Nazik santrifüj (1.000 x g'de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası.
  • Fc blok tampon içinde tekrar süspansiyon ve hücreler 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Piyasada bulunan Fc blok tampon bir dizi (örneğin Sıçan anti-fare CD16/CD32, BD Biosciences) olmakla birlikte, biz sadece murin karşı monoklonal IgG 1 salgılar bir sıçan B hücresi hibridoma (ATCC 2.4.G2) harcanan orta kullanmak Bu adım için Fcγ reseptörleri.
  • Yukarıdaki gibi nazik santrifüjleme (1.000 x g'de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası.
  • İstediğiniz dilusyondaki hücre süspansiyonları doğrudan fluorofor konjuge antikorlar ekleyin ve sürekli sallanan ile 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
  • Konu nazik santrifüj plaka (1.000 x g'de 5 dakika) ve süzünyavaşça tersine plakası tarafından süpernatant.
  • Akış tampon 100 ul hücreleri yıkayın.
  • Yavaşça tersine plakası ile 5 dakika ve süzün süpernatant 1.000 xg'de plaka santrifüjleyin.
  • Yeniden süspanse hücre akış tamponu 300 ul ve PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM pH 6 MgCl2) 100 ul oluşan 400 ul tespit tampon,.
  • Konu bir FACSCalibur hücreleri ya da denk kullanılarak akış sitometrisi. Hücre Görev Pro yazılımı sürüm 5.2 kullanarak sonuçları analiz edin.
  • 3. PP Cryosections hazırlanması

    1. Doku toplanması öncesinde, 7x7x5 mm plastik taban kalıpları Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) bileşiği ekleyin. Ayrıca bir Dewar veya buz kovasının içinde sıvı azot (> 750 ml) bir havuz hazırlamak.
    2. Fare Euthanize ve yukarıda tarif edildiği gibi, bir laparotamy gerçekleştirir. Islak kağıt havlu üzerine bağırsak ve yer çıkarın.
    3. Karşıcyrosectioning için PPs yalıtmak, PBS içeren bir Petri kabı tek PP ve transfer doku içeren ince bağırsak 0,5 cm transvers segmentler kesti. Yavaşça istenmeyen fekal enkaz kaldırmak için PBS ile bu segmentlerin lümen durulayın.
    4. Dikey Ekim içeren taban kalıpları içine bağırsak dokusundan segmentleri yerleştirin. Sıvı azot içinde kalıp daldırın ve doku (1-2 dk) tamamen dondurmak için izin verir. Doku tamamen donduğunda OCT rengi berrak beyaza dönüşecektir. . Daha kademeli bir soğutma (örneğin OCT çatlama azaltmak için) için, sıvı azot buharı ile soğutulur izopentan bir banyo daldırın kalıp Not: sıvı nitrojen ile çalışırken uygun güvenlik gözlükleri takın.
    5. Forseps kullanarak sıvı azot dondurulmuş taban kalıpları çıkartın ve kalıp OCT blok kenarları yumuşatmak için izin yeterince uzun oda sıcaklığında (~ 10-15 sn) az ısınmasını bekleyin. O andan itibaren OCT donmuş blok kaldırmak içinkalıp, kalıp ters çevirin ve alüminyum folyo temiz bir 4 x 4 cm parça üzerine blok çıkarmak için tekrar üzerine hafifçe bastırın. Hemen sıvı azot veya kuru buz üzerinde depolanan bir etiketli numune torbaya folyo ve yerde doku sarın. Alternatif olarak, bir dondurucu (<-20 ° C) içinde doku aktarın. Bir hafta içinde doku kullanın, aksi blokları yaş kırılgan olacak.

    Cryosectioning

    1. Cryosection bir Leica CM3050S cryomicrotome ya da eşdeğerini kullanarak doku. Kriyostat üzerindeki odasının sıcaklığı -21 ayarlanmış olmalıdır ° C
    2. Kalınlığı 12-14 mikron olan bölümler için çalışıyoruz.
    3. Fisher SuperFrost Plus (veya eşdeğer) cam mikroskop Slaytlarınıza bölümleri toplayın ve standart bir düşük güç ışık mikroskobu kullanılarak görsel inceleyin. Birden çok bölümlü bir slayt üzerinde toplanan ediliyor, onlar aşağı boyama uygulamaları için bir araya kümelenmiş emin olun.
    4. Mağaza to bir slayt kutusunda oda sıcaklığında slaytlar ve ideal bir kaç gün içinde bunları kullanmak.

    Cryosections Antikor Etiketleme ve Konfokal Mikroskop Analizi

    1. 2 dakika süreyle doku boyama kavanoz ya da raflar aseton içinde daldırın slaytlar (ya da metanol). Uzun süreli inkübasyon slayt ayırmak dokularda neden olabilir.
    2. Yeni boyama kavanoza slaytlar aktarın ve 3 dk her PBS-T (% 0.05 Tween-20 ile 1X PBS) ile 3 kere yıkayın.
    3. Bir ImmEdge hidrofobik kalemle bölümleri çevreler. Bu reaktifler ve antikor inkubasyon sırasında bu alanı sınırlı kalır sağlayacaktır.
    4. Işıktan korumalı bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dk için, blok tamponunda slaytlar (PBS içinde% 2 keçi serumu) inkübe edin.
    5. 37, 10 dakika için Fc blok tamponu (yukarı bakınız) ile inkübe slaytlar ° C.
    6. PBS-T ve Kimwipes veya diğer emici dokusu kullanılarak bölümler çevresinde kuru alanda Dip slaytlar.Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin.
    7. Kaplama 37 doku 30 dakika için birincil antikor çözeltisi ile inkübe ° nemlendirilmiş bir oda içinde C ile bölümleri. Primer antikor tipik olarak 20 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona blok tamponu içinde seyreltilir. En çok üç antikorlar bu aşamada direkt olarak kombine edilebilir, çünkü doğrudan doğruya-etiketli primer antikorların kullanılması arzu edilir. Doğrudan etiketli antikorlar ek antikor inkübasyon aşaması için ihtiyacı ortadan kaldırır.
    8. Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar.
    9. Eğer bir nem odasında 37 ° C 'de 30 dakika süre ile ilgili ikincil antikor ile gerektiğinde inkübe kayar.
    10. Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar.
    11. Yukarıda açıklandığı gibi PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid içinde 4 dk için slaytlar inkübe edin.
    12. 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar durulayın.
    13. Kuru Kimwipes kullanarak bölümleri çevresindeki alanı veya diğer absorbeent doku. Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, yavaşça bölümüne doğrudan Altın montaj orta Prolong bir damla yerleştirin. Kabarcıkları önlemek için dikkat çekici montaj ortam üzerine bir cam lamel uygulayın. Herhangi bir aşırı montaj orta absorbe kurutma kağıdı kullanın.
    14. Ticari oje ve kurumaya bırakın ile mikroskop slaytlar Seal lamelleri.
    15. Leica TCS SP5 veya eşdeğeri konfokal mikroskop ile slaytlar görüntüle.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80'in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler kuluçkaya, son adımda, oda sıcaklığında (yerine buz on) de izolasyon adımları sırasında PP hücreleri inkübe ve bir "kötü hücre hazırlama" hazırlanmıştır ) arabellek. Bu zayıf hücre hazırlama yöntemlerinde, hücrelerin büyük bir kısmını alçak FSC ve yüksek SSC gösterirler ve belirtilen kapı R1 (Şekil 2B) dışındadır. Bu hücreler olasılıkla apoptoz ve / veya nekroz geçiyor.

    Şekil 3. Dört di bir kokteyl kullanımı kadar gösterirPP tek hücre süspansiyonları hücre tipleri çeşitli arasında ayırımcılık fferent fluorofor konjuge monoklonal antikorlar. Farklılaşma küme (CD) belirteçleri CD19 ve B hücreleri Geçitli PP hücre popülasyonunun ~% 60 (Şekil 3A) oluşturduğunu B220 serimlemektedir ile Etiketleme. Spesifik T hücre alt grupları kolayca CD3 ve CD4 (Şekil 3B) veya CD3 ve CD8 (Şekil 3C) karşı antikorlar ile çift etiketleme tarafından numaralandırılan olabilir. CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin toplam PP hücreleri sırasıyla ~% 23 ve ~% 9, oluşturmaktadır. DC'ler altkümesine etiketli CD11c + (Şekil 3B) ve CD103 + (gösterilmemiştir) da bu yöntem ile numaralandırılmış edilebilir. CD11c + DC'ler PP 10.000 DC'ler eşdeğerdir toplam kapı nüfusu, yaklaşık% 8 oranında katkıda bulunur. Bu tam diğerleri 14 tarafından gözlemlenen DC'lerin sayısı ile kabul eder.

    CD11c'nin nüfusu arasında + + için çift pozitifti. PP hücreleri C57B / 6 fareler (Şekil 3E) den tahsil edildiğinde de benzer sonuçlar elde edilmiştir.

    "Kötü" Hücre preparatlarının Ölü veya ölmekte olan hücreler non-spesifik antikor bağlama eğilimi, büyük ölçüde çünkü son derece yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, B hücresi işaretleyicisi (B220) ve T hücre işaretleyicileri (CD3, panel A, CD4, panel B) her ikisi için de pozitif leke hücre popülasyonunun, iyi ve arasında 3-kat daha fazla göre değişebilir kötü hücre hazırlanması. Şekil 4, bir fazla B220 + ve (Panel A), hücrelerin CD3 + çift pozitif temsil yanı sıra, B220 gösterir + B hücreleri ve CD4 + T hücrelerinin zayıf hücre preparatları da çift-pozitif hücrelerin (Panel B). Yukarıda bahsedildiği gibi, rölatif B ve T-hücresi sayısındaki fark zayıf karşı iyi bir hücre ölüm muhtemelen antikorların spesifik olmayan bağlanma nedeniyle.

    Tüm protokol ayrıca, fare PP cryosections histopatolojik analizler, hem de immün için müsait olduğunu gösteriyor. Şekil 5, fare PPs parafin (panel A, B) ve dondurulmuş bölümleri (panel C) H & E boyama karşılaştırır. Kesitler H & E ile boyanan hücresel düzeyde daha fazla çözünürlük sağlarken, PP germinal merkezleri aydınlık ve karanlık bölgelerin daha kolay cryosection bölümler (Şekil 5A-C) demarcated vardır. H & E-lekeli cryosections immunolabeled cryosections ile yan-yana karşılaştırma için yararlıdır. B hücreleri seçmek için DC'ler ve anti-B220 antikorları seçmek için, T hücrelerinin, anti-CD11c antikor etiketlemek için, anti-CD3 antikoru ile lekelenmiş bir normal PP cryosection Şekil 6 'da gösterilmiştir.

    Şekil 1
    Şekil 1. Fare Peyer kullanıcısının patcÜç görünür PPs (beyaz oklar) ile yeni eksize fare ince bağırsağın hes. Image. PPs bağırsak serozanin anti-mezenterik tarafında blister benzeri yapılar (5 x 5 mm) olarak görünür.

    Şekil 2,
    Şekil 2. Flow sitometri ile analiz Toplam PP hücreleri. Toplam PP hücre monodisperse süspansiyon BD FACSCallibur kullanılarak akış sitometri tabi tutuldu. İyi bir hücre hazırlama (A) Örnek. Hücrelerin büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre parçalı bir göstergesi göstermektedir. Bu hücreler R1 kutulu. R1 kapı dışında bulunan düşük ve yüksek FSC SSC, ile Hücreler ölü veya ölmekte olan hücreler olarak kabul edilir. Hücrelerin büyük bir kısmını, kapının dışında olduğu bir zayıf hücre preparatı, (B) ÖrnekR1 düşük FSC ve yüksek SSC nedeniyle.

    Şekil 3
    Şekil 3,. PP toplam hücre PP lenfositlerin Örnek akış sitometrik analizi. Monodisperse süspansiyonlar florofor ile konjuge primer antikorlar ile inkübe edildi ve sonra akış sitometresi için tabi tutulmuştur. PP B hücreleri (A), CD19 ve B220 etiketleme. (BC) toplam hücre popülasyonlarının çift etiketleme CD3 ve CD4 (B) veya CD8 ile (C) spesifik T hücre alt grupları numaralandırılamıyor. (D) B220 (B hücre belirteci) için toplam hücre popülasyonlarının çift etiketleme ve CD11c (DC işaretleyici). (E) Karşılaştırma B220, CD3 , CD4 ve BALB / c ve C57B / 6 farelerinden PP hücreleri CD11c boyama.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Yoksul PP Hücre preparatlarının sonucunda Yanıltıcı flow sitometri verileri. İyi (sol panel) ve kötü (sağ panel) PP Hücre preparatlarının (A) antikorları ile boyandı B ve T hücre popülasyonları veya (B) antikorları ayırt etmek için B220 ve CD3 B220 ve T hücrelerinin bir alt kümesi gelen B hücreleri ayırt etmek CD4. Sol paneller de gösterildiği gibi, B220 ve CD3 veya CD4 için pozitif leke hücreleri çok az sayıda hücre, genellikle vardır. Buna karşılık, zayıf hücre preparatları içinde çift-pozitif hücreleri toplam hücrelerin yaklaşık% 20'sinden. Bir "kötü" hücre hazırlama neyin oluşturduğunu ile ilgili daha fazla detay için metne bakınız.

    Şekil 5,
    Şekil 5,. Örnek H & E boyalı PP bölümler. Parafin kesitler (A, B) veya ileal PP cryosections (C)H & E ile boyandı ve ışık mikroskobu ile görselleştirilmiş edildi. lenfoid foliküllerin aydınlık ve karanlık bölgeleri kolayca parafin kesitleri karşılaştırıldığında, cryosections demarcated unutmayın. Kısaltmalar: V, villöz; FAE, folikül ilişkili epitel; SED, alt-epitelyal kubbe; LF, lenfoid folikül.

    Şekil 6
    Şekil 6. Mürin PP cryosections arasında immünofloresan etiketleme. Taze PP, hava ile kurutulmuş, aseton-fikse edilmiş, ve (A) FITC-konjuge anti-CD3 antikoru arası foliküler bölgelerde T hücreleri etiketlemek için ve lekeli bir tek fare doku kesitleri Lamina propriya, (B) PE-konjuge anti-CD11c antikorlar SED DC'ler vurgulamak için, ve (C) APC-konjuge anti-B220 antikorları B hücreleri seçmek için (d) bir bileşik o.AC Fiji yazılımı kullanılarak oluşturulan paneller f görüntüler. Ölçek çubuğu ~ 100 mikron.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 6 toplam PP hücreleri arasındaki verimleri özetlemektedir. Biz genellikle fazla 20-25 PPs havuzu yapmamasına rağmen bizim deneyim büyük ölçüde, agregasyon oluşur ve hücre verimleri (ve canlılığı) düşüş nedeniyle Scale-up, mümkündür. Kritik bir kitle başarıyla tüm izolasyon prosedürü yoluyla hücrelere taşımak için gerekli olan diğer taraftan, biz, bu protokol için az 15 PPs kullanmanızı tavsiye etmiyoruz. Maksimal hücre canlılığı aşağı fonksiyonel için bir öncelik isedeneyleri, biz izole hücrelerin küçük bir örnek daha doğru yolluk toplam PP hücre popülasyonu gelen hücrelerin canlı havuzu için izin propidium iyodür boyama tabi öneririz. Son olarak, bizim yöntem, belirli bir hücre alt adoptif transfer için ya da in vitro analiz örneğin, arzu edildiği takdirde uygulamalarda ayırma hücre için müsait olduğu not edilmelidir.

    PP dokuların gerçek kesit zor olabilir ancak cryosectioning için PPs toplanması, nispeten daha basittir. Bu PP doku doğru enine kesitler elde edilir sağlamak için (kalıp taban yani dik) kalıplar içinde uygun şekilde yönlendirilmiş olduğu, örneğin, bir zorunluluktur. Bu ek doku dondurma PP önermek ve genel olarak hücre ve alt-hücresel resol bir azalma tespit ediciler sonucu çökelterek olsa da, daha sonra antikor reaktivitesi ("antijenite") korumak için aseton veya metanol gibi bir fiksatif Çöktürme için tabi cryosectionsution. Antijenite koruyarak belirli bir endişe değilse, o zaman kullanımı tavsiye çapraz bağlama paraformaldehid (PFA), hücresel ve hücre altı yapılar daha iyi korunması sonucu gibi fiksatif. Gerçekten de, PFA önce cryosectioning için dokuların düzeltmek için kullanılabilir. Basitçe,> 2 saat için% 4 PFA, bol miktarda yeni eksize PPs sokmak fazla sabitleştirici çıkarmak için PBS ile yıkayın doku, eğer arzu edilirse şeker, doku (% 15) dengeye ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi, OCT içinde yerleşirler. Daha sonra doku cryosectioned olabilir, fakat önceki immüno-reaktif için kalıntı PFA gidermek için glisin çözeltisi (15 dakika boyunca PBS içerisinde 0.1 M) ile bloke edilmiş olması gerekir.

    Biz PP cryosections arasında immünofloresan etiketlenmesi için protokoller tarif varken Nihayet, bu aynı bölümlerde piyasadan temin IHC kitleri (örneğin Vektör Labs, Burlingame, CA) kullanılarak immünohistokimyasal (İHK) mükellef bulunmaktadır. IHC için, bir peroksidaz ya da bloke edici QuEnc eklemek için gereklidirendojen peroksidaz bağırsak mukozasında oldukça yaygın olarak protokolde hing adım. Diğerleri IHC için, PBS içinde% 4 paraformaldehid farelerin kalp perfüzyon doku koruma geliştirir kaydetti var.

    Özetle, biz lenfositler ve DC'lerin dahil mürin PP hücreleri, kantitatif ve fonksiyonel analiz için paralel ve tamamlayıcı protokoller sağlamıştır. Cryosections bir immün spesifik hücre tipleri yeri, hem de in situ olarak mevcut hücre-hücre etkileşimleri ile ilgili bilgi sağlar iken tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması, PPS büyük hücre tipleri in vitro analiz kantitatif ve fonksiyonel sağlar. Bu yaklaşımların her ikisi de birincil sınırlama ne PP hücre-hücre etkileşimleri "gerçek zamanlı" görselleştirme temsil etmesidir. En azından şu an için, PPs intravital görüntüleme, lenfosit dynami anlayışı devrim bir tekniktir vurdumduymaz kanıtlanmıştırperiferik lenf düğümlerinde cs. PPs intravital görüntüleme sınırlayıcı teknik engelleri aşmak kadar, protokollerin belirli alt immünolojik işlevlerini araştıran ve anlamanın birincil yolu kalır akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için bu makalede özetlenen PPs hücre-popülasyonları, bağırsak ile ilişkili lenfoid doku birincil indüktif siteleri.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgements

    Biz hücre analizi ve kesitler hazırlamak için Helen Johnson (Wadsworth Merkezi Hayvan Histopatoloji Çekirdek) yardım için Renjie Song (Wadsworth Merkezi Akış Sitometri Çekirdek) teşekkür ederim. Biz konfokal mikroskopi ve görüntü toplama konusunda yardım almak için Dr Richard A. Cole (Wadsworth Merkezi Işık Mikroskobu Çekirdek) teşekkür ederim. Biz animasyonlar ile yardım için Andy Bentley (Wadsworth Center Fotoğraf ve İllüstrasyon) kabul etmek istiyorum.

    MDJ Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. SA Wadsworth Merkezi-Sağlık Araştırma A.Ş. intramural doktora sonrası dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH hibe HD061916 ve GM082978 tarafından kısmen desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics